南方红豆杉水提物抑制裸鼠A549肺癌移植瘤生长及其机制研究

来源:用户上传      作者: 崔庆丽 邵梅 舒琦瑾

　　[摘要] 目的：研究南方红豆杉水提物对裸鼠A549肺癌移植瘤生长的抑制作用和机制。方法：建立荷A549肺癌移植瘤模型，随机分为对照组、低、中、高剂量南方红豆杉水提物实验组，24 h后以等体积生理盐水及药物灌胃，给药7周，每3 d测移植瘤长短径，绘制移植瘤生长曲线，给药7周后处死裸鼠，取瘤组织，计算抑瘤率，采用Real-time PCR及Western blot方法检测mRNA和蛋白水平。结果：南方红豆杉水提物各剂量组均有明显抑瘤效果（P<0.05）。与对照组相比，各实验组移植瘤组织中EGFR及Survivin mRNA水平明显下调（P<0.05），VEGF mRNA水平无明显变化。灰度值之比分析显示：各实验组移植瘤组织中EGFR及VEGF蛋白水平均有下调趋势，但差异无统计学意义，Survivin及p-EGFR蛋白水平明显下调（P<0.05）。结论：南方红豆杉水提物对血管生成无明显影响，可能通过抑制Survivin蛋白，抑制EGFR磷酸化，起到抑制移植瘤生长的效果。
　　[关键词] 南方红豆杉；A549肺癌；移植瘤；抑制作用
　　南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K为红豆杉科红豆杉属，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。红豆杉药用价值在中医学中早有记载，《本草纲目》记载红豆杉功效消肿散结，主治肿瘤、肾病、风湿等。从红豆杉树皮和枝叶中提取的紫杉醇，是国际上公认的防癌抗癌的药剂。而与紫杉醇相比，南方红豆杉水提物安全有效，是国内临床应用的主要形式。已有研究表明南方红豆杉水提物抗肿瘤作用机制与紫杉醇明显不同[1]，紫杉醇抑制肿瘤细胞的机制主要为细胞毒作用，而南方红豆杉可能通过降低P-jnk蛋白表达诱导细胞凋亡，其主要有效成分并非紫杉醇。已有体外实验表明南方红豆杉水提物可通过抑制Survivin蛋白，诱导凋亡[2]等途径抑制A549细胞增殖[3]起到抗肿瘤效果，但目前尚未见南方红豆杉水提物（AETC）抑制肿瘤的体内实验报道。
　　本实验通过建立荷A549肺腺癌裸鼠模型，观察南方红豆杉水提物在体内水平对裸鼠移植瘤生长的抑制作用，采用Real-time PCR法及Western blot法检测移植瘤组织中mRNA及蛋白水平，初步探讨南方红豆杉体内抗肿瘤机制。
　　1 材料
　　1.1 仪器 Elx808型酶标仪（美国BioTek公司）；BX20型荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司）；DK-80型电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；3111型水套式CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；SIM-F140型制冰机（日本SANYO公司）；Nanopure UV/UF型超纯水器（美国Thermo公司）；MP4+ChemidocXRS型蛋白印记检测系统（美国Bio-Rad公司）；核酸电泳仪及电泳槽（美国Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）；ABI9700PCR扩增仪（美国ABI公司）；ABI7500全自动荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
　　1.2 药物及试剂 南方红豆杉购自浙江省中医院中药房，宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生产。Hylcone胎牛血清（美国Thermo公司），F12-K培养液（美国GIBCO公司），EGFR，p-EGFR（Y1068），Survivin，一抗（美国Cell Signaling Technology公司），VEGF及β-Tubulin一抗（美国Abcam公司），羊抗兔二抗（美国Santa Cruz公司），ECL化学发光试剂盒（美国Millipore公司），PVDF膜（美国Millipore公司），EGFR，Survivin，VEGF，GAPDH引物（上海生工生物工程有限公司），SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（Takara 公司），PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Takara 公司）；氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂均为国产分析纯（上海化学试剂公司）。
　　1.3 动物 SPF级6周龄雄性裸鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2008-0016。由浙江中医药大学动物实验中心提供无特定病原体（specified pathogens free，SPF）级层流架中，笼具、垫料、饮水、饲料均经灭菌处理，饲养和实验处理按照无菌操作规范操作。
　　2 方法
　　2.1 药物制备 取适量南方红豆杉在冷水中充分浸泡0.5 h，然后加药物5～10倍的冷水，煮沸后控温电炉保持微沸30 min，用滤网过滤药渣后将其作为高剂量母液，浓煎至208 g·L-1，按照1∶2和1∶4分别稀释为中剂量和低剂量。药品保存在4 ℃冷藏冰柜中。
　　2.2 细胞培养及处理 人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物学研究所。用体积分数为 10%的胎牛血清 F12-K培养液，在 37 ℃，5%的CO2培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。
　　2.3 动物模型建立及分组给药 取1×107个/mL的A549单细胞悬液，每只裸鼠颈背部皮下接种0.2 mL。接种后将48只裸鼠随机分为对照组、南方红豆杉水提物低、中、高剂量组（0.52，1.04，2.08 mg·g1），每组12只。接种后24 h灌胃给药，每天1次，每次0.2 mL。中剂量为临床人用剂量按照人和动物等效剂量折算法得出。成瘤后每3 d测移植瘤长径及短径，连续给药7周后处死，剥取瘤组织，称重后液氮保存。移植瘤体积按通用标准公式[4]V=a×b2/2计算肿瘤体积（V为移植瘤体积，单位mm3，a为移植瘤最长径，b为移植瘤最短径，单位均为mm）。观察肿瘤生长速度，绘制裸鼠移植瘤生长曲线。 　　2.4 Real-time PCR检测mRNA水平 取50～100 mg移植瘤组织，Trizol法提取总RNA，Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度，确定RNA的纯度及浓度，A260/A280在1.8～2.0。按试剂盒说明进行PCR逆转录后，荧光定量PCR仪进行扩增。以管家基因GAPDH为内参基因，设计引物如下：Survivin上游引物5′-CTACCGAGAACGAGCCTGATT-3′，下游引物5′-AGCCTTCCAATTCCTTAAAGCAG-3′，扩增产物长度60 bp；VEGF上游引物5′-TTTGGCAAATACAACCCTTCAGA-3′，下游引物5′-GCAGAAGATACTGTCACCACC-3′，扩增产物长度133 bp；EGFR上游引物5′-ATGAAAACACCTATGCCTTAGCC-3′，下游引物5′-TAAGTTCCGCATGGGCAGTTC-3′，扩增产物长度83 bp；GAPDH上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，扩增产物长度123 bp。反应条件：95 ℃ 3 min，1个循环进行预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，循环40次。熔解曲线分析：95 ℃ 15 s，20 ℃·s1；60 ℃ 15 s，20 ℃·s1；95 ℃ 15 s，0.1 ℃·s1。荧光定量结果采用2-ΔΔCt方法分析，统计相对表达量RQ（relative quantification）值。
　　2.5 Western blot检测蛋白表达 取液氮保存的肿瘤组织，生理盐水冲洗，切取重约20 mg小块，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂的裂解液，碎冰上高速机械匀浆器12 000 r·min1破碎组织，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，等量上样，10%SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗（1∶3 000）室温摇床孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL显色后化学发光成像系统成像。以Quatity one图像分析软件进行积分吸光度值分析。
　　2.6 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件进行分析处理。计量资料数据用±s表示，各组间差别选用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异， P<0.01为有非常显著性差异。
　　3 结果
　　3.1 裸鼠A549皮下移植瘤模型的建立 接种后4～5 d，可见接种部位处皮下小结节，质韧，游标卡尺测量结节大小相近，最长径约3～5 mm，最短径约2～4 mm。之后每日观察，结节缓慢增大，至接种第10天，最长径约4～6 mm，最短径约3～5 mm。48只裸鼠全部成瘤，瘤体大小相近，成瘤率100%。
　　3.2 荷瘤裸鼠一般生长状况 接种后24 h开始灌胃，灌胃7周后结束实验，至实验结束时各组荷瘤裸鼠均无死亡。各组移植瘤瘤体圆形或不规则形，色灰白或灰红，质韧，至实验后期因瘤体增大，可见瘤体表面血管密布，色紫红。
　　3.3 南方红豆杉水提物对裸鼠A549移植瘤的影响 各组初始瘤体积组间差异无统计学意义，瘤体大小一致性较好，观察期间，对照组生长速度最快（图1）。裸鼠移植瘤生长曲线显示，用药至第7周，低剂量和高剂量抑瘤效果好，但高、中、低剂量组间差异无统计学意义。实验结束剥取瘤组织，称重，各用药组瘤重明显低于对照组（P<0.01），瘤重抑制率分别为47.53%，39.59%，46.47%（表1）。
　　3.4 南方红豆杉水提物对裸鼠A549移植瘤VEGF等基因 mRNA表达的影响 Real-time PCR方法检测VEGF，Survivin，EGFR mRNA表达，熔解曲线分析显示各个引物扩增均具有单峰的熔解曲线图，提示引物的荧光定量PCR扩增具有特异性。每个样品做3个复孔，根据各样品扩增曲线，用2-ΔΔCt方法分析统计相对表达RQ（表2），与对照组相比，南方红豆杉水提物对裸鼠A549移植瘤VEGF mRNA表达无明显影响，明显降低EGFR及Survivin mRNA水平（P<0.05）。
　　3.5 南方红豆杉水提物对裸鼠A549移植瘤VEGF等蛋白表达的影响 A549裸鼠移植瘤模型建立后连续给药7周后，与对照组相比，各实验组VEGF，EGFR蛋白无明显差异，而Survivin，p-EGFR蛋白表达有下降趋势。用Quantity one软件分析并与β-Tubulin条带灰度值相比结果（图2）显示：与对照组相比，随着南方红豆杉水提物剂量增加，VEGF，EGFR 蛋白表达差异不具有统计学意义，Survivin及p-EGFR蛋白表达明显下降 （P<0.05）。
　　4 讨论
　　肺癌是全球范围内癌症死亡的主因之一，而非小细胞肺癌占肺癌的80%～85%。中医药在肺癌的综合治疗中因其安全有效、低毒、多靶点等优势，越来越受关注，从中医药中寻求更新更有效的抗肿瘤药物已成为当前研究热点。
　　肿瘤的血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移的基本条件，抑制肿瘤血管生长一直是肿瘤治疗的一个热门方向。肿瘤组织可分泌多种促血管形成因子，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）目前被认为是最重要的因子之一。VEGF具有增加微血管的通透性、促进不同来源内皮细胞分裂增殖和血管构建，促使内皮细胞迁移[5]等多种作用，是目前已知最强的血管生成诱导因子，其他血管生成因子大都通过增强VEGF的表达产生促血管生成的作用。非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展的早期，就有肿瘤细胞从原发灶通过血道播撒，在Ⅰ期的NSCLC，有30%～50%的患者会出现骨髓的隐性转移，这通常是预后不良的因素[6]。因此，阻断VEGF的表达和生成，在理论上来说可以作为肿瘤治疗的靶点，抑制肿瘤的生长和转移[7]。 　　本实验研究结果表明，南方红豆杉水提物干预荷肺癌A549移植瘤裸鼠后，对比对照组，各实验组移植瘤组织中VEGF mRNA表达无明显影响，VEGF蛋白表达有下降趋势，但无统计学意义，提示南方红豆杉水提物可能对肺癌A549移植瘤的血管生成无明显影响。
　　Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitorofapoptosis，IAP）的新成员，是目前发现最强的凋亡抑制因子，其功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化并参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用[8-9]。Survivin具有肿瘤特异性，几乎表达于所有的恶性肿瘤，但在人体正常终末分化的组织细胞中不表达或低表达，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。肺癌患者血清中，同样可以检测出Survivin 抗体。Survivin因其独特的生物学特性有望成为肺癌治疗的新靶点。
　　本实验研究表明，南方红豆杉水提物干预荷肺癌A549移植瘤裸鼠后，对比对照组，各实验组移植瘤组织中Survivin mRNA及蛋白表达水平均明显下降，且具有统计学意义，这与体外实验结果一致[10]，提示抑制Survivin表达有可能是南方红豆杉水提物体内抗肿瘤机制之一。
　　表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种相对分子质量为170 KD的跨膜糖蛋白，配体通过与EGFR相互作用，激活下游RAS/MAPK系统、PI3K/AKT系统、PLC/PKC系统，从而将有丝分裂信号向下传递，调控细胞周期，调节细胞增生、存活、黏附，促进损伤修复[11]。此外，EGFR信号通路激活后可促进细胞的增殖、转移、浸润、血管生成以及阻断细胞调亡。恶性组织中EGFR的表达水平高于正常组织，在40%～80%非小细胞肺癌患者中EGFR呈过度表达。因此，阻断或者削弱EGFR信号通路是治疗非小细胞肺癌的一条有效途径。
　　本实验研究结果表明，南方红豆杉水提物干预荷肺癌A549移植瘤裸鼠后，对比对照组，各实验组移植瘤组织中EGFR mRNA水平明显降低（P<0.05），EGFR蛋白表达水平未见明显降低，而p-EGFR蛋白水平明显降低（P<0.05）。EGFR水平无明显变化，而其磷酸化水平减低亦见于其他抗肿瘤药物相关研究。南方红豆杉水提物有可能通过抑制EGFR磷酸化，弱化EGFR信号通路，从而抑制细胞的增殖、转移、浸润、血管生成以及促进细胞调亡，起到抗肿瘤效果。肿瘤生长曲线图显示各剂量组在用药5周后显示出差异，提示各剂量组抗肿瘤效果与用药时间有相关性。对比抑瘤率、Survivin及p-EGFR蛋白表达水平，各剂量南方红豆杉水提物组间无统计学差异，提示低剂量南方红豆杉水提物即可显示抗肿瘤效果，高剂量并未显示最佳抑瘤效果，可能与药效时间累积有关，是否提示临床用药量偏大尚需进一步研究。
　　综上所述，通过本实验分析南方红豆杉水提物体内抗肿瘤机制，提示南方红豆杉水提物可能对血管生成无明显影响，可能通过抑制Survivin蛋白，抑制EGFR磷酸化，起到抑制裸鼠移植瘤生长的效果。
　　[参考文献]
　　[1] 徐颖扉，张晶，舒琦瑾. 南方红豆杉水提物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡与紫杉醇抑瘤机制不同的研究[J]. 中华中医药杂志，2012，27（6）：1696.
　　[2] 舒琦瑾，李萍，王彬彬. 南方红豆杉水提物诱导人肺癌A549细胞凋亡及其分子机制的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志，2011，31（9）：1243.
　　[3] 舒琦瑾，李萍，王彬彬，等. 南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞增殖抑制作用的研究[J]. 中华中医药杂志，2011，26（12）：2982.
　　[4] Naito S， von Eschenbach A C， Giavazzi R， et al. Growth and metastasis of tumor cells isolated from a human renal cell carcinoma implanted into different organs of nude mice[J]. Cancer Res，1986，46（8）：4109.
　　[5] Osaki T， Oyama T， Inoue M， et al. Molecular biological markers and micrometastasis in resected non-small-cell lung cancer[J]. Jpn J Thorac Cardiovasc Surg，2001，49（9）：545.
　　[6] Byrne A M， Bouchier-Hayes D J， Harmey J H. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor （VEGF）[J]. J Cell Mol Med，2005，9（4）：777.
　　[7] Thomas J， Liu T， Cotter M A， et al. Melanocyte expression of survivin promotes development and metastasis of UV-induced melanoma in HGF-transgenic mice[J]. Cancer Res，2007，67（11）：5172.
　　[8] Badran A， Yoshida A， Ishikawa K， et al. Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivin[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，314（3）：902. 　　[9] Pal S K， Pegram M. Epidermal growth factor receptor and signal transduction： potential targets for anti-cancer therapy[J]. Anticancer Drugs，2005，16（5）：483.
　　[10] Zhang X， Zhang H， Tighiouart M， et al. Synergistic inhibition of head and neck tumor growth by green tea （-）-epigallocatechin-3-gallate and EGFR tyrosine kinase inhibitor[J]. Int J Cancer，2008，123（5）：1005.
　　[11] 张文颖，张为民，王林，等. 多西他赛与吉非替尼序贯应用对人肺腺癌细胞SPC-A1生长及信号蛋白的影响[J]. 中国肺癌杂志，2011，14（5）：385.
　　Study on inhibitory effect of aqueous extract of Taxus chinensis var. mairei on
　　growth of A549 lung cancer xenografts in nude mice and its mechanism
　　CUI Qing-li1， 3， SHAO Mei2， 3， SHU Qi-jin3*
　　（1. Oncology Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Henna Provincial Oncology Hospital，
　　Zhengzhou 450008， China； 2. No. 81 Hospital of PLA， Nanjing 210002， China；
　　3. First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Provincial Hospital of
　　Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310006， China）
　　[Abstract] Objective： To study the effect of aqueous extract of Taxus chinensis var. mairei （AETC） on the growth of A549 lung cancer xenografts in nude mice and its mechanism. Method： The A549 lung cancer xenograft model was established， and then randomly divided into the control group， and low， middle and high dose AETC experiment groups. After 24 hours， they were orally administered with normal saline and drugs of the same volume for seven weeks. The length and width of the xenografts were measured every three days， and the xenograft growth curve was drawn. The nude mice were sacrificed after the administration for seven weeks， and their xenografts were collected to cultivate the anti-tumor rate. Real-time PCR and Western-blot were adopted to detect mRNA and protein levels. Result： All of AETC experiment groups showed a significant anti-tumor effect （P<0.05）. Compared with the control group， each experimental group showed notable reduction in EGFR and Survivin mRNA in xenograft tissues （P<0.05）， with no significant change in VEGF mRNA level. The analysis on gray value ratio showed that EGFR mRNA were down-regulated （P<0.05） in xenograft tissues in all experimental groups， but with no statistical significance in difference， and Survivin and p-EGFR were significantly down-regulated. Conclusion： AETC has not significant effect on angiogenesis， but may have the inhibitory effect on xenograft growth by inhibiting Survivin protein and EGFR phosphorylation.
　　[Key words] Taxus chinensis var. mairei； A549 lung cancer cell； xenograft； inhibitory effect
　　doi：10.4268/cjcmm20132028
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