运用HPLC结合PCA技术对不同炮制程度的姜炭中5个姜辣素成分的含量比较研究

来源:用户上传      作者: 于江泳　陈求芳　卢国勇

　　[摘要] 建立同时测定不同炮制程度姜炭中5个姜辣素成分的含量，并采用PCA主成分分析法进行比较分析。 采用Ultimate TM XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱，检测波长为280 nm，流速0.6 mL・min-1，柱温30 ℃。5个成分分离度良好，标准曲线在线性范围内相关性良好，r≥0.999 7。加样回收率均值在98.86%～101.5%，RSD 1.4%～2.9%。不同炮制程度姜炭所含姜辣素成分在组分和含量上均存在一定差异，姜酮在标炭中含量最高，姜辣素类成分随着炮制程度的加深，含量依次降低。PCA模式识别显示不同炮制程度的姜炭聚为3类，为建立姜炭的质量标准提供了科学依据。
　　[关键词] 不同炮制程度姜炭；姜辣素；主成分分析；HPLC
　　[Abstract] To establish a new method for simultaneously determining the content of five gingerol compounds in different processing degrees of ginger charcoal and PCA principal component analysis was conducted for analysis. Samples were analyzed on Ultimate TM XB-C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm）， with acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） as mobile phase for gradient elution. Detection wavelength was set at 280 nm. The flow rate was 0.6 mL・min-1 and the column temperature was 30 ℃. The five compounds were separated well and showed good linearity （r≥0.999 7） within the concentration ranges tested. The average value for recoveries was between 98.86%-101.5%（RSD 1.4%-2.9%）. The contents of five compounds showed difference among different processing degrees of ginger charcoal. Zingiberone had the highest content in the standard carbon， and the content of gingerol was decreased as the deepening of processing degree. Different processing degrees of ginger charcoal were classified into three groups with PCA， and provided scientific basis for establishing the quality standards of ginger charcoal.
　　[Key words] different processing degrees of ginger charcoal； gingerol； principal component analysis； HPLC
　　doi：10.4268/cjcmm20152115
　　姜炭为干姜按照炒炭法制成的炮制加工品，味微苦，微辣。具有温经止血、温脾止泻的功效，主治虚寒性吐血、便血、崩漏、阳虚泄泻等症[1]。姜炭和干姜尽管均来源于姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎，但由于炮制方法不同而具有不同的药效。干姜性热而偏燥，以温中散寒，回阳通脉，温肺化饮为主；姜炭辛味消失，守而不走，专攻止血温经，固涩止血效果较强，临床多用于虚寒型出血症[2]。姜炭的主要药效活性成分有6-，8-，10-姜酚，6-姜烯酚，姜酮等姜辣素类成分。研究表明，姜辣素类成分具有抑制血小板聚集、改善心血管功能，治疗眩晕、呕吐，改善胃肠道功能，增强免疫力，消炎之作用，还具有很强的抗氧化能力 [3-5]。姜炭炮制后，辛辣味减弱，与其辣味成分（姜辣素及分解物6-姜烯酚、8-姜烯酚）含量下降有关。目前《中国药典》中关于姜炭的质量控制项目收载于干姜标准项下，选取的指标和干姜相同，既难以反映干姜炮制后物质基础和药效的变化，也与中医药理论中“生熟异治”、“炒炭止血”不相符。课题组在起草姜炭炮制规范研究中发现，不同炮制程度姜炭的吸附力、鞣质含量、pH变化具有一定规律性；其中，标炭的灌胃小鼠的凝血时间、出血时间最短，炮制不及或炮制太过，止血药效都会降低[6]。故本实验拟进一步采用HPLC对姜炭不同炮制程度的药效活性成分6-，8-，10-姜酚，6-姜烯酚，姜酮5种成分进行含量测定，并结合主成分分析（principal components analysis， PCA）方法对其含量进行比较分析，以期为单独建立姜炭的鉴别和质量控制指标提供科学依据。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　Agilent 1120高效液相色谱仪（G1314A UV检测器，G1313A自动进样器，G1316柱温箱）和Agilent Chemstation色谱工作站，电子天平（Sartorius BP211D）， DS-8510型超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司），PCA分析软件为SIMCA-P+12.0版。 　　1.2 药品
　　干姜：干姜饮片购自广州市药材公司中药饮片厂，经中药鉴定教研室马鸿雁副教授鉴定为姜科植物姜Z. officinale的干燥根茎。
　　不同炮制程度的姜炭：取干姜饮片，采用2010年版《中国药典》附录收载的炮制通则项下砂烫法炮制，以砂子温度为310 ℃炮制7～10 min，至饮片表面外焦黑内黄色为轻炭；13～17 min，至饮片表面外焦黑内棕褐色为标炭；18～22 min，至饮片表面外黑内焦黑为重炭[6]。
　　1.3 对照品与试剂
　　6-姜酚（北京金宝在线科技有限公司，批号23513-14-6），10-姜酚（上海纯优生物科技有限公司，批号P0131），6-姜烯酚（上海纯优生物科技有限公司，批号P0621），8-姜酚（南通飞宇生物科技有限公司，批号FY13430828），姜酮（南通飞宇生物科技有限公司，批号FY13451769）。实验所用试剂甲醇、乙腈为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　Ultimate TM XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），0～10 min，25% ～ 35% A，10 ～40 min，35%～ 75% A，40 ～ 60 min，75% ～ 85%A；检测波长280 nm；进样量10 μL；流速0.6 mL・min-1；柱温30 ℃。在上述色谱条件下，各成分之间分离度良好，对照品及样品的色谱图见图1。
　　2.2 对照品溶液制备
　　分别取姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为2.21，5.00，4.00，4.49，2.19 g・L-1的对照品溶液。分别精密移取上述5种对照品溶液10，48，25，50，100 μL置于1 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液，于4 ℃保存备用。
　　2.3 供试品溶液的制备
　　取不同炮制程度的姜炭（轻炭、标炭、重炭）粉末各0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶，精密加入20 mL甲醇，称定，超声40 min（功率300 W，频率25 Hz），补足失重，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，分别取其续滤液作为供试品溶液。
　　2.4 方法学考察
　　2.4.1 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述混合对照品溶液0.5，1，2.5，5，7.5，10，15 μL进样分析，记录色谱图。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程见表1。同法以进样浓度为横坐标，以每个浓度所对应的信噪比值为纵坐标进行线性回归，分别求得信噪比为3和10的对照品浓度，即为该对照品的检测限和定量限，结果见表1。
　　2.4.2 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为1.8%，0.84%，2.0%，0.65%，0.92%，表明仪器的精密度良好。
　　2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8，12，24，36，48 h进样，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为2.5%，1.9%，2.7%，2.3%，1.4%，表明处理后的供试品溶液在48 h内稳定良好。
　　2.4.4 重复性试验 称取同一标炭粉末约0.5 g共6份，按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精确吸取供试品溶液10 μL，测定峰面积，计算含量。结果6批样品中，姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚的平均含量的RSD分别为2.4%，2.0%，1.5%，2.7%，2.5%，表明重复性良好。
　　2.4.5 加样回收率试验 称取已知含量的标炭粉末约0.25 g，共6份，精密称定，分别加入一定量的对照品，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。
　　2.5 不同炮制程度姜炭含量测定
　　精密称定不同炮制程度姜炭样品各0.5 g，按2.3项下方法制备，每个样品平行2份，并按2.1项下色谱条件进行测定，采取外标法计算各个样品中5个成分的含量，并对各个成分在不同炮制程度中进行t检验，结果见表3。
　　由表3可以明显看出，不同炮制程度的姜炭中各成分含量有明显区别，除姜酮外（标炭含量最高）各成分均随着炮制程度的加深，含量依次降低；在重炭中除了6-姜烯酚外，大多数样品中其余4个成分均检测不到。轻炭中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量分别约为标炭的2.4，7.5，1.6倍；6-姜烯酚含量是标炭和重炭的53，34倍。t检验结果发现，除了姜酮在轻炭和标炭中的含量没显著性差异外，其余各成分标炭与轻炭、重炭都有极其显著的差异。
　　2.6 PCA分析
　　将姜炭的不同炮制品（轻炭、标炭、重炭）的10批各成分含量数据的导入SIMCA-P+12.0版PCA软件，以5个成分的含量为特征变量值，将数据标准化后进行PCA分析，结果见图2，3。 由图2可看出不同炮制程度的姜炭被分为3类，说明不同炮制程度的姜炭在组成和含量上有显著区别；而标炭和轻炭离散度较大说明轻炭和标炭各批次间仍存在一定差异，可能与各批次间药材质量和炮制工艺规范程度有关。变量的重要性差异图3可以看出，变量中姜酮和8-姜酚大于1，在姜炭不同炮制程度的区分中具有显著的贡献率。
　　3 讨论
　　根据姜炭传统炮制质量要求结合药效学，得到不同炮制程度的姜炭中化学成分含量差异较大，除姜酮外，其他姜辣素类成分都存在不同程度的降低。其机制在于姜辣素炮制过程中受热后发生不同程度的分解或裂解，姜辣素类物质结构中含有的5-羟基-3-酮基结构，对热不稳定，易发生脱水反应生成姜烯酚，并且发生逆Diels-Alder反应生成姜酮[7-9]。故标炭的姜酮成分含量增加，而随着炮制程度的加剧及炮制时间的延长，姜烯酚和姜酮类成分继续发生脱水和裂解反应而含量逐渐降低，故在姜炭的重炭样品中各成分含量均减少或检测不到。前期药效学试验结果显示标炭止血效果最好，优于轻炭和重炭，故“炮制不及”（轻炭）或“炮制太过”（重炭）都不能很好的发挥出炭药“炭药止血”的药效，从而进一步阐明了“炒炭存性”的科学内涵，揭示姜炭“辛味消失”的物质成分变化规律。
　　同时，该研究采用HPLC测定姜炭不同炮制程度中姜辣素类和姜酮成分的含量，并采用主成分分析和t检验，对结果进行分析，结果显示不同程度炮制品含量变化较大，必须进一步规范姜炭的炮制工艺，才能保证临床疗效。该方法简单可行，重复性好，也可为姜炭饮片的质量控制和《中国药典》修订提供重要的科学数据。
　　[参考文献]
　　[1] 中国药典.一部[S].2010：13.
　　[2] 中华人民共和国药典临床用药须知：中药饮片卷 [S]. 2011：554.
　　[3] 蒋苏贞，宓穗卿，王宁生.姜酚心血管药理作用研究进展[J].时珍国医国药，2007，18（1）：219.
　　[4] 周萍，彭咏波，李萍.6-姜烯酚抗肿瘤机制研究进展[J].中南药学，2012，10（7）：536.
　　[5] 黄小桃.姜酮在大鼠体内的药物代谢动力学研究[D].广州：广州中医药大学，2009.
　　[6] 孟江，许舒娅，陈磊，等.干姜“炒炭存性”质量标准初探[J].中国中药杂志，2012，37（4）：453.
　　[7] 徐晓青，洪燕，夏伦祝，等.不同炮制温度和时间对炮姜中姜酮含量的影响[J].安徽中医药大学学报，2014，33（5）：86.
　　[8] Zhao Z Z， Liang Z T， Chan K， et al. A unique issue in the standardization of Chinese materia medica： processing[J]. Planta Med， 2010（76）：1975.
　　[9] Cai B C， Qin K M， Wu H， et al. Chemical mechanism during chinese medicine processing[J]. Prog Chem， 2012（24）：637.
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