槲皮素对兔骨关节炎模型关节液中IL―1β、TNFα水平的影响

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　　摘要：目的：观察中药槲皮素对骨关节炎动物模型关节液中细胞因子IL-1β、TNFα水平的影响。方法：按照hulth法建立兔膝关节骨关节炎模型，20只实验动物随机等分成4组：①槲皮素组。②塞来昔布组。③生理盐水组。④模型组。各治疗组分别给予药物治疗4周，然后抽取关节液。ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF α的含量。结果：槲皮素组、塞来昔布组关节液中.IL-1β、TNFα水平均显著低于模型组（P<0.01）。结论：槲皮素、塞来昔布能够抑制OA模型关节滑液中IL-1B、TNFα的水平。、
　　关键词：骨关节炎；槲皮素；塞来昔布
　　中图分类号：Q959.836；R684.3 文献标志码：A 文章编号：1008―2409（2015）04―0005―04
　　骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种随着年龄增长而发病率也逐渐增加的进行性关节疾病，发病机理至今尚未十分明确，故也没什么特效的治疗药物。近年的研究表明炎性细胞因子IL-1β、TNFα在OA的发生发展过程中起到了非常重要的作用，OA动物模型及OA的关节中均检测出较高水平破的IL-1β与TNFα，IL-1β和TNFα是主要炎性细胞因子参与骨关节炎（OA）。这些细胞因子干扰软骨细胞代谢，抑制细胞外基质蛋白的合成，促进分解代谢的蛋白酶的释放，坏了软骨细胞，从而形成骨关节炎，被认为是在关节炎发病机制中起关键作用的促炎症性细胞因子。IL-1β是重要的炎症介质，参与关节软骨破坏的起始和进展。在正常人关节液中IL-1含量极少，IL-1B占主要成分。然而在OA患者关节液中IL-1B含量明显升高，且与OA的病理表现呈正相关。TNFα可刺激滑膜细胞产生PGE2，增加软骨下骨的吸收，引起关节软骨Ⅱ型胶原的破坏，并且与OA的疼痛有着密切的关系，此外OA发生时滑膜细胞和软骨组织大量分泌TNFα，促使滑膜组织的增生，并诱导成纤维细胞增生，形成大量的血管翳，致关节软骨破坏，最终可以导致关节功能障碍。
　　中医药治疗是我国防治骨关节炎的一大特色，中药不仅可以调节机体免疫功能、减少复发及改善特应性体质，许多中药还可减少蛋白酶和细胞因子的形成，对于骨关节炎疼痛的缓解，关节功能的改善有明显的疗效，且不良反应小，槲皮素又称栎精、槲皮黄素等，是一种植物源性五羟基黄酮类化合物，具有较高的营养与药用价值。槲皮素多以苷的形式存在于一些水果、蔬菜和草本植物中。槲皮苷等在经过酶或酸作用后，水解成槲皮素。日前已在上百种中草药中发现槲皮素的存在，且已有研究证实槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节等多种生物活性，榭皮素对硝化应激诱导损伤的细胞具有保护作用，其机制可能与榭皮素可提高细胞内ERK通路有关。
　　实验探讨槲皮素对兔骨关节炎模型关节液中IL-1β、TNFot水平的影响作用机制，为临床应用提供实验依据。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物
　　健康成年雄性新西兰白兔22只，体重2.0～2.5 kg，由桂林医学院实验动物中心提供。
　　1.2实验药品与试剂
　　槲皮素：由北京友谊医院中药房煎制；塞来昔布：200 mg/粒，由美西尔大药厂生产；家兔细胞因子IL-1B、TNFot ELISA检测试剂盒，由解放军301医院放免所提供。
　　1.3实验仪器
　　-20℃低温冰箱；恒温箱；离心机；SN-695B型放免测量仪；普通病理设备。
　　1.4动物模型与实验分组
　　22只新西兰兔2只留做检测模型是否成功用，其余22只随机分为4组；每组5只。于动物手术室切断前交叉韧带，参照文献方法建立Hulth模型：将动物从耳缘静脉麻醉后仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面，手术后不固定伤肢，给予自由活动，给予青霉素20×104/d肌肉注射3 d，预防感染，手术后7 d驱赶动物在小动物跑台上奔跑，30min/d，分2次驱赶，驱赶动物4周后即得明显的模型。4周后处死检测兔，解剖膝关节并行大体观察及取股骨内髁关节软骨标本送普通病理检查，结果证实兔膝关节骨关节炎模型制作成功（图1、2）。
　　1.5实验方法
　　1.5.1模型成功后即给予药物治疗①槲皮素组：榭皮素每日药汁灌胃10.31 mg・kg-1d-1。②塞来昔布组：塞来昔布每日灌胃1次，20 mg/次。③盐水组：每日灌胃生理盐水10.31 mg・kg-1・d-1。④空白组：无药物治疗。全部动物治疗饲养4周，然后抽取关节液。
　　1.5.2抽取关节液：施行膝关节穿刺抽取关节液，用2.5 ml一次性无菌注射器加入生理盐水1 ml对膝关节反复抽吸使冲洗液混匀，最后抽干膝关节腔液体。将抽吸的关节液以3 000 r/min离心20min，收集上清液，最后获得关节液0.5 mY膝，将其注入试管内-20℃低温冰箱保存。
　　1.6检测方法
　　双抗体ELISA法IL-1β、TNFα测定：采用ELISA双抗体夹心法（按试剂盒说明书进行操作），取上述获得的关节液200μl，确定所需的已包被兔IL-1β/TNFα抗体的酶标板孔数目，依次加入倍比稀释的兔IL-1B/TNFα标准品和标本液，反应90min，自动洗板机洗涤2次，加入物素化兔IL-1β/TNFα抗体工作液，反应60min，洗涤3次，加入ABC工作液，反应30 min，洗涤5次，加人3，4，5-三甲氧基苯甲醛显色工作液，避光反应，显色后加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛终止液。酶标仪在450 nm测定吸光度值，根据吸光度值计算样品IL-1β/TNFα的浓度。
　　1.7统计学处理 　　数据处理应用SPSS 10.0软件。治疗组与对照组的比较应用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义，多组间两两比较应用q检验。
　　2结果
　　各组IL-Iβ、TNFα测定结果见表1。槲皮素组、塞来昔布组关节液中IL-1β、TNFα水平均较空白对照组低，差异具有统计学意义（P<0.01）；生理盐水组关节液中的IL-1p、TNFa水平均与空白对照组差异无统计学意义（P>0.05）；槲皮素组模型关节液中IL-1β、TNFα水平均显著高于塞来昔布组（P<0.05）。
　　3讨论
　　笔者利用动物实验的方法观察了2种治疗OA的药物对OA模型关节液中细胞因子IL-1β、TNFα的影响。IL-1β与TNFα是非常重要的炎性细胞因子，多项研究表明OA关节中IL-1 β与TNFα水平明显升高，IL-1β与TNF α是OA病理过程中重要的一环。Santangelo等研究发现OA时软骨细胞和滑膜细胞分泌IL-1β明显增加，并且对IL-1β的敏感性也显著增加，同时增加的IL-1β可使软骨细胞和滑膜细胞上调MMPs的表达，加剧炎症反应，导致软骨基质降解，并加速关节软骨的破坏。IL-1可使滑膜细胞合成和分泌胶原酶和PGE2，刺激滑膜组织产生炎症反应，加速软骨基质的降解，最后导致关节软骨的破坏。在OA患者滑液、滑膜组织、软骨中IL-1β和TNFα呈高表达状态。IL-1β和TNFα同时可促进大量的炎性和分解性因子分泌并产生放大级联反应，促进关节软骨的破坏，加速OA病情的发展。
　　实验复制的大鼠膝骨关节炎模型，Hulth法建立兔OA模型具有创伤小，模型可重复性好，病理改变接近人类OA软骨的病理改变的特点，造模4周时软骨退变以粗糙糜烂等OA早中期改变为主。目前为学者广泛从大体以及光镜下观察到关节充血、水肿、肥厚，关节液量增多，滑膜细胞增生活跃，且有明显的炎细胞浸润，软骨表面有不同程度的糜烂、缺损，软骨细胞排列紊乱，细胞减少。这些表现与骨关节炎的病理形态学变化相一致，说明模型复制成功。
　　实验中槲皮素组、塞来昔布组关节液中IL-1B、TNFα水平均较空白对照组低于模型对照组，表明槲皮素、塞来昔布能够阻止关节液中IL-1β、TNFα的产生，对IL-1β、TNFα的产生起到一定的抑制作用。塞来昔布是COX-2特异性抑制剂，属于NSAID类药物，NSAID药物因能快速缓解骨关节炎症状而被大范围使用，塞来昔布因具有较小的胃肠道不良反应被认为是治疗OA的理想药物，但是塞来昔布因为其胃肠道和心血管危险性，使其不能作为骨性关节炎的长期维持治疗，所以临床医生一直寻找一种疗效显著，不良反应小、经济的治疗药物，中医药正是具有以上优点。实验结果表明OA动物模型经槲皮素与NSAID类药物一样也具有抑制患者关节炎症的潜在作用。黄熹等认为槲皮素在这个体系中，具有显著的抗氧化作用，能提高细胞的抗氧化能力，降低细胞的凋亡。槲皮素能明显减少GS-NO损伤后的内皮细胞LDH的释放，减少MDA的产生，提高SOD，GSH-PX的活性，抑制ROS的产生，抑制Caspase-3的激活，从而具有保护GS-NO诱导损伤的内皮细胞的作用，并且具有抗炎和组织保护作用。槲皮素可能是抑制了一氧化氮的表达，从而抑制了炎性因子IL-1β、TNFα的表达。这还需要实验进一步去证实。
　　总之，实验结果显示早期应用槲皮素能与临床上治疗骨关节炎的常用药塞来昔布产生类似的效果，能降低关节液IL-1 B和TNFα的水平，说明槲皮素能防治早期兔膝OA的形成，表明槲皮素可以考虑在目前临床上用于治疗骨关节炎。
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