对氧磷酶1参与香猪高脂模型脂质代谢研究

来源:用户上传      作者: 徐霖 李升(等)

　　徐霖 李升１，３，冉雪琴１，３，王嘉福１，３
　　（１．贵州大学动物科学学院，贵阳 ５５００２５；２．贵阳学院生物与环境工程系，贵阳 ５５０００５；
　　３．贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室，贵阳 ５５００２５）
　　
　　摘要：猪动脉粥样硬化形成过程和解剖特征与人极为相似，为研究动脉粥样硬化发病机理，建立了贵州小香猪高脂模型，并设了对照组。通过饲养试验，测定猪动脉粥样硬化形成过程中与脂质代谢密切相关的４种关键因子，即血清总胆固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ， ＳＯＤ） 及对氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１， ＰＯＮ１）活性，研究PON1与脂质代谢之间的关系。研究结果显示，PON1在香猪高脂模型中活性降低。
　　关键词：动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）；对氧磷酶1（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１）；脂质代谢；香猪；高脂模型
　　中图分类号：Ｒ５７５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1404-03
　　
　　Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1 ｏｎ Ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ Pｉｇ
　　
　　ＸＵ Ｌｉｎ１，２，ＬＩ Ｓｈｅｎｇ１，３，ＲＡＮ Ｘｕｅ－ｑｉｎ１，３，ＷＡＮＧ Ｊｉａ－ｆｕ１，３
　　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００５， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇｓ， ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｅｔ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｓ closely ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｐｏｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＴＣ（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＬＤＬ（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＨＤＬ（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ dｉｓｍｕｔａｓｅ） ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ （pａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１） ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＰＯＮ１ ａｎｄ ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉaｎｇ ｐｉｇｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ； ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1； ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ； Ｘｉａｎｇ ｐｉｇ； ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ
　　
　　近年来，越来越多的基础和临床研究进一步证实动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）是一种累及血管、代谢和免疫等多系统的炎症性疾病，但其确切病因及发病机理目前尚未完全阐明。对氧磷酶１（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）因水解神经毒杀虫剂对氧磷（Ｐａｒａｏｘｏｎ）而命名，血清ＰＯＮ１是肝脏分泌的一种能够水解多种有机磷化合物的钙离子依赖性酯酶， 具有重要的抗氧化作用。
　　在不同动物中有关对氧磷酶研究较多，但目前在大型牲畜中研究动脉粥样硬化发病机制还存在不少空白。猪动脉粥样硬化形成过程和解剖特征与人极为相似，本试验通过建立贵州小香猪动脉粥样硬化模型，测定与脂质代谢密切相关的4种关键因子：血清总胆固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）及对氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）的活性，研究对氧磷酶１与脂质代谢之间的关系，为研究动脉粥样硬化发病机制提供大型牲畜的模型数据参考。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 材料
　　试验用小香猪购自贵州榕江（１０头）。
　　采血方法：上腔静脉窦采血，５ ｍＬ/头，血清测酶活性及各项指标。
　　１．２ 方法
　　１．２．１ 动脉粥样硬化模型建立 １０头小香猪分为对照组和试验组，每组５头。对照组只喂给基础饲料，试验组于基础饲料中拌入１５％蛋黄粉（或者猪油）、４％胆固醇。基础饲料平均按２５ ｇ／（ｋｇ・ｄ）分２次给予。
　　１．２．２ 一般临床观察 每日观察小香猪的一般临床表现，每月称１ 次体重。
　　１．２．３ ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＳＯＤ测定 分别用ＴＣ测定试剂盒、ＬＤＬ测定试剂盒、ＨＤＬ测定试剂盒、ＳＯＤ测定试剂盒（以上试剂盒均为南京建成生物工程有限公司生产）进行测定。
　　１．２．４ Ｐ０Ｎｌ活性的测定 血清ＰＯＮ１活性的测定采用连续测定方法［１］，以对氧磷为底物，在８００ μＬ甘氨酸缓冲液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＯＮ， ｐＨ １０．５）中加入２０ μＬ的血清，血清中的ＰＯＮ１可以催化对氧磷水解产生有色物质对硝基酚，通过紫外分光光度计在４０５ ｎｍ波长处每隔１０ ｓ共３ ｍｉｎ连续测定吸光度值，算出平均吸光度变化值，根据公式 ＰＯＮ1（Ｕ／Ｌ）＝△Ａ／ｍｉｎ×ＴＶ×１０６／（ε×ＳＶ×Ｌ ）求出单位体积血清ＰＯＮ1活性。式中△Ａ／ｍｉｎ为每分钟吸光度变化值，ＴＶ为反应总体积（ｍＬ），ＳＶ为样本体积（ｍＬ），Ｌ为比色杯光径（１ ｃｍ），１０６是将ｍｏｌ换算成μｍｏｌ的系数，ε为对硝基酚在４０５ ｎｍ波长处的摩尔消光系数１７ １４３（ｃｍ２／ｍｏｌ）。

　　１．２．５ 统计分析 测得数据用ＳＰＳＳ １３．０软件处理后用（ｘ±ｓ）表示，采用ｔ检验法检验组间及组内差异。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 体重测定结果
　　通过连续３２周的饲喂，对照组和高脂组体重均有增加（图１）。对照组体重由（２１．１±３．１） ｋｇ增加到（３９．９±５．５） ｋｇ，增加８９．１％，而高脂组体重从（１７．０±１．９） ｋｇ增加到（４８．５±６．６） ｋｇ，增重１８５．３％，增重程度显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。
　　２．２ 血脂水平变化情况
　　本试验对对照组和高脂组的血清总胆固醇（ＴＣ）、高密度脂蛋白（ＨＤＬ）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ）分别进行了监测（图２），相对于对照组，高脂组的血清ＴＣ、ＬＤＬ和ＨＤＬ含量均在１６周之前增长迅速，与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５），在１６周时增幅均达到最大值，而对照组在整个试验过程中各指标变化无显著差异。高脂组的血清ＴＣ含量在１６周时为（４．０６±０．４５） ｍｍｏｌ／Ｌ，相对于对照组［（２．１５±０．３１）ｍｍｏｌ／Ｌ］增加了８８．８％，差异极显著（Ｐ＜０．０１）；而高脂组的ＬＤＬ和ＨＤＬ含量在１６周时分别为（１．２３±０．１５） ｍｍｏｌ／Ｌ和（１．３６±０．１２） ｍｍｏｌ／Ｌ，分别为同时期对照组的１．２倍和１．１倍，统计学分析差异显著（Ｐ＜０．０５）。在１６周后，高脂组中的ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ含量有所降低，但在３２周时，ＴＣ和ＨＤＬ含量仍明显高于对照组（Ｐ＜０．０５），ＬＤＬ含量略高于对照组。根据以上３个指标的变化，说明高脂饲料饲喂香猪１６周后可以显著增加其血脂水平。
　　２．３ 血液中氧化水平相关指标测定
　　为了进一步评价高脂饲料对猪体氧化水平的影响，本试验选取测定ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性来判断（图３）。从图３可以看出，相对于对照组，高脂组的ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性均明显降低，在１６周后下降趋势维持在一个稳定的状态。相对于对照组，高脂组中ＳＯＤ酶活性最低值出现在２４周，为（７３．５４±１４．３２） Ｕ／ｍＬ，仅为同时期对照组的６４．９％（Ｐ＜０．０１）；而ＰＯＮ１酶活性最低值出现在３２周，为（６．１３±０．１５） Ｕ／Ｌ，为同时期对照组的８０．９％（Ｐ＜０．０１）。香猪血液中的ＳＯＤ和ＰＯＮ１酶活性的降低说明高脂饲料增加了猪体的氧化水平。
　　
　　
　　３ 小结与讨论
　　动脉粥样硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）发病机理十分复杂，目前尚未完全阐明［２］。越来越多的证据表明ＰＯＮ1在脂蛋白代谢中起着重要作用，并进而影响冠心病和动脉粥样硬化的发生。人类ＰＯＮ1在血液中结合ＡｐｏＡＩ而紧密固定在高密度脂蛋白颗粒上发挥抗氧化作用，抑制低密度脂蛋白氧化修饰以及水解溶血磷脂等具有生物活性的脂质过氧化物，是重要的抗氧化酶［３］。动物试验表明剔除ＰＯＮ１基因的实验鼠经过高脂喂食后，其高密度脂蛋白和低密度脂蛋白较对照鼠更易于受到氧化攻击，而ＰＯＮｌ过度表达的鼠类动脉粥样斑块明显减少［４］。又据报道，ＰＯＮ１在糖尿病和心血管系统等疾病中活性明显下降，也有力地支持ＰＯＮ1的抗氧化作用［５］。可见在正常生理情况下，人体内存在许多抗氧化剂和抗氧化酶能够有效及时地清除氧自由基而维持动态平衡，但其分子机制有待进一步研究。猪动脉粥样硬化形成过程和解剖特征与人极为相似，可作为研究ＡＳ的理想模型。
　　本试验中建立的贵州小香猪模型随着时间的推移，其体重、血清ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ均明显升高，说明高脂食品饲喂加速了小香猪动脉粥样硬化进程。在此过程中，高脂饲喂使香猪体内脂质过氧化物积聚，引发氧化应激反应，抑制ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性。另一方面，试验中观察到１６周为一分水岭，在１６周后，血清ＴＣ有小幅降低并维持在一个相对稳定的水平，ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性也不再下降，维持在一个相对稳定的状态，这是一种生理适应。因此，ＳＯＤ和 ＰＯＮ１活性下降加速自由基产生，引发细胞内大分子物质核酸、蛋白质和脂肪酸发生一系列氧化损伤，可能是动脉粥样硬化的主要发病机制。本试验建立了贵州小香猪动脉粥样硬化模型，为研究ＰＯＮ１作用与脂质代谢之间的关系提出了新的研究方法和思路。
　　参考文献：
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