提取甲壳素的乳酸菌发酵工艺优化

来源:用户上传      作者: 陈亚

　　摘要：以地产克氏螯虾（Procambarus clarkii）虾壳为原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）发酵的方法提取甲壳素，并对发酵工艺进行优化研究。结果表明，发酵的最佳工艺组合为发酵温度37 ℃，发酵时间96 h，葡萄糖加入量5%，固液比1.0∶3.0（m/V，g∶mL），发酵起始pH 5.5。采用上述组合，所得甲壳素产率达13.9%。该工艺具有显著的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。
　　关键词：甲壳素；制备；乳酸菌（Lactococcus lactis）发酵；克氏螯虾（Procambarus clarkii）虾壳
　　中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4607-03
　　甲壳素（Chitin）又名几丁质、壳多糖、甲壳质、聚乙酰氨基葡萄糖等，化学名称为（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，分子式为（C8H13NO5）n，它是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接的一种乙酰氨基葡萄糖。甲壳素是人类继发现淀粉、纤维素之后在地球上发现的第三大生物资源，广泛存在于虾、蟹、昆虫等动物的外壳及植物的细胞壁中，是一种重要的天然高分子多糖。在甲壳素被发现的一个多世纪以来，人们对该类化合物进行了大量的基础研究和应用研究，揭示了其在医药、农业、日化、轻纺、环保等领域广泛的应用价值[1-3]。
　　目前，国内外主要采用传统的化学方法生产甲壳素，生产工艺相对简单，但生产过程中大量使用强酸、强碱会导致严重的环境污染，同时造成水资源的严重浪费。可以说，高污染及浪费水资源已成为影响甲壳素产业生存与发展的瓶颈，严重制约了该产业的持续健康发展。而采用生物工艺，即通过微生物的发酵作用代替化学工艺制备甲壳素，正成为甲壳素生产工艺研究的热点[4，5]。
　　本研究以地产克氏螯虾（Procambarus clarkii）（俗称小龙虾）虾壳为原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）纯种发酵的方法制备甲壳素，以期为甲壳素这一重要生物资源的更好利用以及中国甲壳素生产企业的技术革新提供新的有效途径。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 原料 选新鲜、杂质少、无霉变腐烂和虫蛀现象的地产克氏螯虾虾壳为原料。
　　1.1.2 菌株 菌株为盐城师范学院生命科学与技术学院保藏的乳酸菌种。
　　1.1.3 培养基 MRS液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 0.1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，用去离子水定容至1 000 mL；脱脂乳培养基为市售鲜牛乳。
　　1.1.4 主要仪器 KYC-100C空气恒温摇床购自上海福玛实验设备有限公司，101-A电热鼓风干燥箱购自上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司，FA1604电子天平购自上海良平仪器仪表有限公司，PHS-3C型pH计购自上海雷磁仪器厂。
　　1.2 方法
　　1.2.1 菌种的活化 将保存的乳酸菌菌种用新鲜灭菌脱脂乳活化1代，于37 ℃培养过夜至牛乳凝固，再以体积分数为1%的接种量转接于MRS液体培养基中，于37 ℃培养过夜，重复活化2～3代，直至菌种恢复活力，冷藏备用。
　　1.2.2 发酵液的制备 吸取活化的菌液以体积分数为1.5%的接种量转接于MRS液体培养基中，于37 ℃培养12 h至培养液浑浊，冷藏备用。
　　1.2.3 原料的预处理 地产克氏螯虾虾壳经清洗和去除杂质，于105 ℃干燥4 h，用绞肉机绞碎备用。
　　1.2.4 发酵试验 称取经预处理的地产克氏螯虾虾壳100 g，置于500 mL三角烧瓶中，加入葡萄糖、发酵液。将烧瓶置于空气恒温摇床中，设置转速为250 r/min，进行发酵试验。发酵结束后过滤，用去离子水漂洗至中性，于105 ℃烘箱恒温干燥4 h，即得到白色固态的甲壳素。根据影响发酵进程的因素，以甲壳素产率为分析指标，分别对发酵温度、发酵时间、葡萄糖加入量、固液比和发酵起始pH进行单因素试验，筛选单因素的最佳条件。
　　2 结果与分析
　　2.1 发酵温度
　　温度是影响细菌生长繁殖和发酵产物质量的重要因素之一[6]。发酵温度不同，甲壳素产率亦明显不同（表1）。
　　一般而言，菌体浓度与甲壳素产率成正相关。若发酵温度过低，菌体生长缓慢，菌体浓度不高，从而影响甲壳素产率。若发酵温度过高，菌体培养后期容易衰老而自溶，菌体浓度亦不高，也会影响甲壳素的提取。由表1可知，在一定范围内，甲壳素的产率随发酵温度的升高而增加，在37 ℃时达到最大，为13.7%，继续提高发酵温度，甲壳素产率反而下降，故选择发酵温度为37 ℃。
　　2.2 发酵时间
　　发酵时间对反应进行的程度、甲壳素的产率和质量也有较大影响。由表2可知，随着发酵时间的增加，甲壳素产率随之上升，当发酵时间为96 h时，甲壳素产率达13.8%。继续延长发酵时间，甲壳素产率上升不明显。故综合考虑设备利用率、发酵成本等因素，选择96 h作为较好的发酵时间。
　　2.3 葡萄糖加入量
　　微生物生长繁殖需要一定的碳源，而碳源的浓度对微生物发酵有明显影响。碳源过于丰富，易引起菌体异常繁殖，对菌体代谢、产物合成及氧的传递不利；反之，如果仅仅供给维持量的碳源，则菌体的生长和代谢均受到抑制。以葡萄糖作为乳酸菌发酵的碳源，其加入量与甲壳素产率的关系如表3。由表3可知，葡萄糖加入量为5%时，甲壳素产率最高，发酵效果最好。
　　2.4 固液比
　　在发酵试验中，加入足量的发酵液将原料虾壳完全浸没，是原料发酵充分、提高甲壳素产率的前提。试验结果显示，固液比（m/V，g∶mL，下同）为1.0∶3.0时，可将虾壳表面浸没。因此，研究时分别将固液比设定为1.0∶3.0、1.0∶3.5和1.0∶4.0，研究发现3种固液比下甲壳素产率无明显变化，而发酵时固液比加大，发酵过程中生产用水、发酵残液的总量会随之增大，造成成本增加和副产物深度回收的困难，因而选择的最适固液比为1.0∶3.0。 　　2.5 发酵起始pH
　　乳酸菌在酸性环境中具有较高的活力，采用乳酸菌发酵的方法提取甲壳素，起始pH对甲壳素产率有一定影响（表4）。由表4可知，pH 5.5时甲壳素产率最高，为13.9%，因此选择pH 5.5为最佳的发酵起始pH。
　　2.6 发酵工艺的优化
　　采用上述优化的发酵条件：发酵温度37 ℃、发酵时间96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、发酵起始pH 5.5，利用乳酸菌发酵的方法制备甲壳素，得到甲壳素产率为13.9%，产品质量符合市售甲壳素的质量指标。
　　3 小结与讨论
　　甲壳素作为重要的生物资源，其生产原料主要来自于虾、蟹壳等，虾壳中甲壳素含量约为15%～20%[7，8]。长期以来，人们主要通过化学方法，即采取强酸、强碱处理的方法开展甲壳素提取工艺的研究与应用，例如，郑铁生等[8]以地产龙虾壳为原料，探讨甲壳素提取和壳聚糖制备的方法，其甲壳素得率为14.8%。项东升等[9]以地产龙虾壳为原料，对采用化学方法提取甲壳素的工艺进行优化，使甲壳素得率达到15.0%，并对甲壳素提取过程中产生的废液的处理做了有益的尝试，取得了较好的经济效益和环境效益。而Rao等[10]分别以虾头和虾壳为原料，采用乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵的方法提取甲壳素，甲壳素得率分别为4.5%和13.0%。
　　本研究以经预处理的地产克氏螯虾虾壳为原料，对发酵条件进行了优化，得到优化的发酵条件为发酵温度37 ℃、发酵时间96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、发酵起始pH 5.5。该条件下所得甲壳素产率为13.9%，其质量符合市售甲壳素的质量指标。虽然研究中甲壳素的产率略小于上述化学工艺的研究报道，但采用乳酸菌等微生物发酵的生物工艺提取、生产甲壳素，无需大量使用强酸、强碱，反应条件温和，而且节约水资源，可以显著降低生产成本，减少环境污染。特别值得一提的是，虾壳中除了含有丰富的甲壳素，还富含蛋白质、氨基酸、多肽、脂肪和矿物质等营养物质，目前生产上在提取获得甲壳素后，往往将这些有用物质随同生产废渣废液一起排放到环境中，既造成资源浪费，又产生环境污染。而采用微生物发酵的方法提取甲壳素，可以最大限度地减少有害化学物质的残留，使甲壳中其他有用营养物质的回收利用成为可能，有利于原料的综合利用。
　　地产克氏螯虾虾壳是水产品加工的废弃物，同时又是一种重要的动物性再生资源。本研究以地产克氏螯虾虾壳为原料，采用乳酸菌发酵的方法制备甲壳素，证明通过乳酸菌等微生物发酵生产甲壳素，具有显著的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。
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