紫花地丁水提物急性毒性试验及其抗炎镇痛作用研究
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作者: 李艳丽 胡彦武
摘要：采用二甲苯致小鼠耳肿胀法和鸡蛋清致小鼠足肿胀法研究紫花地丁（Viola philippica）水提物高、中、低剂量（9.0、6.0、3.0 g/kg）抗炎作用，采用热板致痛法和醋酸致扭体反应法研究其镇痛作用，并测定紫花地丁水提物的小鼠最大耐受量（MTD）。结果表明，紫花地丁水提物对小鼠灌胃给药MTD为480 g/（kg・d）。与空白组比较，紫花地丁水提物各剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀及鸡蛋清致小鼠足肿胀均有显著的抑制作用（P<0.05～P<0.01），并能显著减少醋酸致小鼠扭体反应次数（P<0.05～P<0.01），显著提高热板致痛小鼠痛阈值（P<0.05）。表明紫花地丁水提物毒性较低，具有较强的抗炎镇痛作用。
关键词：紫花地丁（Viola philippica）；水提物；急性毒性；抗炎；镇痛
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）02-0390-03
紫花地丁是堇菜科植物紫花地丁（Viola philippica）的干燥全草，性寒味微苦，具有清热解毒、凉血消肿、消痈散结之功效，临床适用于疔疮肿毒、红肿热痛、毒蛇咬伤、痈疽恶疮、喉痹肿痛等病症的治疗[1]。目前对紫花地丁的研究主要集中在化学成分方面，而对其与功效主治相关的药理作用方面的研究报道较少。该研究以紫花地丁水提物为研究对象，运用现代药理学方法对紫花地丁水提物急性毒性及抗炎镇痛作用进行了研究，以期为紫花地丁的临床应用提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 紫花地丁（长春中医药大学附属医院中药房）；布洛芬缓释胶囊（中美天津史克制药有限公司，批号：11090665）；二甲苯（汕头市光华化学厂，批号：20100615）；冰醋酸（沈阳市华东试剂厂，批号：20100908）。
1.1.2 动物 ICR小鼠由长春高新医学动物实验中心提供。
1.1.3 仪器 MP21001型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RB-200型智能热板仪及PV-200型足趾容积测量仪（成都泰盟科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 紫花地丁水提物的制备 将紫花地丁粉碎成粗粉，取粗粉100 g使用纱布包裹，用蒸馏水浸泡1 h后，武火煮沸继以文火煎煮1 h，过滤后同法再煎煮一次，合并两次滤液，并浓缩至100 mL，即1 mL提取液含有1 g生药，置于4 ℃保存。
1.2.2 急性毒性试验 预试验中无法测出0%及100%动物死亡剂量来测定紫花地丁水提物的半数致死量（LD50），故而测定小鼠的最大耐受量（MTD）。取小鼠40只，雌雄各半，随机分为空白对照组和紫花地丁水提物组，每组20只。各鼠均禁食16 h，期间自由饮水，紫花地丁水提物组24 h内以最大浓度（以生药量计浓度为6 g/mL），最大给药体积（0.4 mL/10g）灌胃给药2次，两次给药间隔期间禁食，但自由饮水；对照组给予同体积蒸馏水。连续观察7 d，详细记录两组动物体征变化、体重及摄食量变化及死亡情况[2]。
1.2.3 紫花地丁水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 取小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，即空白对照（蒸馏水）组，布洛芬对照组（布洛芬浓度为0.08 g/kg），9.0、6.0、3.0 g/kg的紫花地丁水提物试验组，灌胃给药连续7 d。末次给药30 min后，于小鼠右耳均匀涂抹二甲苯50 μL/只，左耳不涂作为对照，致炎作用30 min后处死小鼠，剪下双耳耳廓，用直径8 mm的打孔器在双耳同一位置打下耳片，并称其质量，计算肿胀度和肿胀抑制率。肿胀度=右耳片质量-左耳片质量；肿胀抑制率=[（空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/空白对照组平均肿胀度]×100%[3]。
1.2.4 紫花地丁水提物对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响 分组及给药同“1.2.3”，末次给药前测量并记录各鼠右后足容积，末次给药30 min后，于各鼠右后足趾部皮下注射10 %鲜鸡蛋清溶液0.1 mL，并于致炎后的0.5、1.0、1.5、2.0 h分别测量并记录各鼠右后足容积1次，并计算肿胀率。肿胀率=（致炎后足容积-致炎前足容积）/致炎前足容积×100%[4]。
1.2.5 紫花地丁水提物对醋酸致小鼠扭体反应的影响 分组及给药同“1.2.3”，末次给药30 min后，腹腔注射 0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，观察并记录20 min内各鼠扭体反应（伸展后肢、腹部内凹和臀抬高）次数，并计算扭体反应抑制率。扭体反应抑制率=（空白对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/空白对照组平均扭体次数×100%[3]。
1.2.6 紫花地丁水提物对小鼠热板致痛反应的影响 将雌性小鼠放于（55±0.5） ℃热板仪上，将其出现舔后足反应所需时间记为痛阈值，挑选痛阈值在5～30 s内的小鼠50只，随机分组，分组及给药同“1.2.3”，各鼠于用药前及末次给药30 min后分别测定并记录各鼠的痛阈值[4，5]。在测定中，痛阈值超过60 s的记为60 s。
1.2.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，所有数据均用x±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 紫花地丁水提物急性毒性试验结果
给药后部分小鼠出现倦缩或自主活动减少现象，24 h后活动恢复正常。连续观察7 d，无动物死亡情况发生，所有动物呼吸、皮毛、摄食量、体重、大小便等均未见异常。7 d后处死动物，进行解剖，肉眼观察未发现心、肝、肺、肾、脾、子宫、睾丸等器官异常变化。紫花地丁水提物对小鼠的灌胃给药MTD为480 g/（kg・d）（以生药量计）。 2.2 紫花地丁水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
紫花地丁水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响见表1。由表1可知，与空白对照组比较，不同剂量紫花地丁水提物组以及布洛芬组对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有显著的抑制作用，具有显著性差异。紫花地丁水提物抗炎作用表现出剂量依赖性，高剂量组抗炎作用强于中、低剂量组，且与布洛芬组抗炎作用相当。
2.3 紫花地丁水提物对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响
紫花地丁水提物对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响见表2。由表2可知，与空白对照组比较，不同剂量紫花地丁水提物组及布洛芬组对鸡蛋清致小鼠足肿胀均有显著的抑制作用，且抗炎作用持续时间较长，具有显著性差异。紫花地丁水提物抗炎作用呈剂量依赖性，高剂量组抗炎作用强于中、低剂量组，且与布洛芬组抗炎作用相当。
2.4 紫花地丁水提物对醋酸致小鼠扭体反应的影响
紫花地丁水提物对醋酸致小鼠扭体反应的影响见表3。由表3可知，与空白对照组比较，不同剂量紫花地丁水提物组及布洛芬组均可显著减少醋酸所致小鼠扭体反应和次数，差异均具有统计学意义（P<0.05～P<0.01）。紫花地丁水提物镇痛作用呈剂量依赖性，高剂量组镇痛作用强于中、低剂量组，且与布洛芬组镇痛相当。
2.5 紫花地丁水提物对小鼠热板致痛反应的影响
紫花地丁水提物对小鼠热板致痛反应的影响见表4。由表4可知，与空白对照组比较，不同剂量紫花地丁水提物组及布洛芬组均可显著提高热板致小鼠疼痛反应的痛阈值，差异均具有统计学意义（P<0.05）。紫花地丁水提物镇痛作用呈剂量依赖性，高剂量组镇痛作用强于中、低剂量组，且与布洛芬组镇痛作用相当。
3 小结
不同剂量紫花地丁水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀及鸡蛋清诱导小鼠足肿胀均有显著的抑制作用，且抗炎作用呈剂量依赖性，高剂量组抗炎作用强于中、低剂量组。利用热板实验和扭体实验，是来筛选镇痛药的经验实验方法。不同剂量紫花地丁水提物对热板致小鼠产生的疼痛及醋酸所致小鼠慢性持续性疼痛均有显著的抑制作用，可显著提高痛阈值，且镇痛作用呈剂量依赖性，高剂量组镇痛作用强于中、低剂量组。紫花地丁水提物具有显著的抗炎镇痛作用，研究结果与紫花地丁具有清热解毒、凉血消肿止痛等功效有关，为紫花地丁的临床应用及药用开发利用提供了药理学依据，但其抗炎镇痛作用机制及具体药效成分尚有待进一步研究。
参考文献：
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[2] 沙爱龙，陈红玲，孟庆艳.维药芳香新塔花水提物的抗炎镇痛作用及其急性毒性[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（4）：202-204.
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[4] 张大方，金若敏，孟宪丽，等.药理与中药药理实验[M].上海：上海科学技术出版社，2006.
[5] 吴龙火，刘昭文，许瑞安. 九里香叶的抗炎镇痛作用研究[J].湖北农业科学，2011，50（21）：4435-4436.
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