土壤高压蒸汽灭菌的条件优化及其对植物生长的影响

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　　摘要：利用高压蒸汽对土壤灭菌是研究土壤微生物学的常用方法，用高压蒸汽灭菌方法（121 ℃，30 min）对土壤灭菌，调查灭菌次数对土壤灭菌效果、土壤化学性质变化、黄瓜幼苗生长的影响。结果表明，灭菌1次即可完全清除土壤里的真菌，但灭菌3次才可完全清除土壤里的细菌；灭菌土壤的pH值和EC值均显著高于未灭菌土壤，且随着灭菌次数的增加，pH值和EC值都呈现上升趋势；土壤灭菌显著降低黄瓜幼苗的株高和地上部鲜质量，并且随着灭菌次数的增加，黄瓜幼苗的株高和地上部鲜质量都呈现下降趋势；与灭菌2次的土壤相比，灭菌3次的土壤对黄瓜幼苗生长的抑制作用不显著，并且pH值和EC值的变化也不显著。因此，在土壤微生物学研究中需要根据需要选择灭菌次数。
　　关键词：高压蒸汽灭菌；灭菌次数；土壤微生物；植物生长
　　中图分类号： Q93-334；S642.201 文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2016）09-0456-03
　　土壤灭菌能够消除或降低土壤微生物活性，是土壤生物学研究中常用的试验方法。在研究土壤-微生物-植物之间的相互作用、土壤单一菌群、土壤酶、土壤有机质降解与吸附以及杀菌剂在土壤中的移动等方面都要求土壤的无菌环境[1-4]。比如作物连作会降低作物的产量和品质，造成严重的连作障碍。对土壤进行灭菌能够研究土壤微生物对作物连作障碍的“贡献”。季尚宁等对连作大豆的土壤进行灭菌处理后种植大豆，发现经过灭菌的大豆茬土壤栽培的株高、干质量和鲜质量均大大超过了未灭菌的豆茬土壤，缓解了连作障碍[5]；吴凤芝等对连作黄瓜的土壤灭菌后，种植黄瓜幼苗的株高、茎粗和根系活力都显著高于未灭菌土壤中的植株[6]。
　　目前常用的土壤灭菌方法有高温灭菌法、γ射线灭菌法、化学熏蒸法、苯菌灵抑制法和物理割断法等5种常用方法。这5种方法各有利弊：高温灭菌法、γ射线灭菌法和化学熏蒸法适用于室内试验，但它们对土壤理化性质有一定的影响；化学熏蒸法会污染环境；苯菌灵抑制法和物理割断法适用于室外试验，其中苯菌灵抑制法也会污染环境，须严格控制药剂用量；物理割断法虽然环保，但可能影响土壤中水分和营养成分的交换[2-3，7-9]。
　　在众多的土壤灭菌方法中，高压蒸汽灭菌是实验室普遍使用的方法，国内外大量研究报告中都采用高压蒸汽灭菌方法进行土壤灭菌[3，10-11]。高压蒸汽灭菌的效果受到灭菌的温度、灭菌时间、灭菌次数等条件的影响，并且高压蒸汽灭菌能够引起土壤理化性质的改变，进而影响植物的生长。Mahmood等用121℃高压蒸汽对土壤灭菌1 h，显著提高了土壤的电导率、水溶性碳和可溶性锰，提高了小麦根的生物量、根长、表面积、体积及根尖数[3]。Verhagen等为研究根际细菌诱导的系统抗性，对土壤进行蒸汽灭菌2次，每次20 min[8]。李会娜等对土壤进行高压灭菌3次（121 ℃、30 min，连续3 d），发现菜园土灭菌后，紫茎泽兰的株高和生物量显著低于对照处理（未灭菌），而对于番茄的生长具有促进作用[12]。梁智等用高压蒸汽灭菌，在1 个大气压下高温湿热灭菌2 h，使棉花株高降低12.7%，地上部干物质质量减少66.7%，地下部干物质质量减少44.5%[13]。由此可见，对于土壤的高压蒸汽灭菌的条件比较混乱，没有统一的标准，最重要的是没有验证不同灭菌条件下的灭菌效果。目前对于高压蒸汽灭菌的温度、时间、次数、灭菌效果及其对植物生长的影响尚未见报道。本试验在前人研究的基础上，研究灭菌次数对土壤真菌、细菌的清除效果，以及对黄瓜幼苗生长的影响，以期对利用高压蒸汽进行土壤灭菌的条件进行优化，为相关研究提供参考和借鉴。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 供试品种 黄瓜品种为津研四号，购自天津科润黄瓜研究所。
　　1.1.2 供试土壤 土壤为采自东北农业大学园艺站的育苗土。
　　1.2 方法
　　1.2.1 土壤灭菌 试验共设4个处理：未灭菌（CK）、灭菌1次（CS1）、灭菌2次（CS2）、灭菌3次（CS3）。将2 kg土壤样品装入直径为25 cm、长度为40 cm的灭菌袋（高密度聚乙烯膜，北京鑫明宏塑料有限公司）中图1，于立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）中灭菌，每次灭菌的条件为121 ℃（0. 1～0.2 MPa）高温灭菌30 min。每次灭菌间隔24 h。
　　1.2.2 灭菌土壤中细菌和真菌的培养和数量检测 参照Komad等的方法[14-15]，用平板培养法测定黄瓜根际土壤中细菌和真菌的数量。细菌测定采用牛肉膏蛋白胨培养基；真菌测定采用马丁氏培养基。
　　[FK（W13][TPCP1.tif]
　　本试验中所用的灭菌袋每袋装入2 kg土，是为了保证灭菌效果和高压灭菌器的容积，使其更有利于灭菌。将每个处理的土壤随机取出3袋，在超净工作台（DL-CJ-2ND，北京东联哈尔仪器制造有限公司）中取袋中间部分的土壤5 g，加入到盛有45 mL无菌水的锥形瓶（250 mL）中，振荡15 min使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，静置1 min后依次制成10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀释液。
　　在超净工作台中，依次在分离细菌和真菌的培养基上用平板涂布法涂布10-5、10-3、10-2的土壤稀释液100 μL，每个处理重复3次，每个重复涂布5个平板。置于28 ℃恒温培养箱中暗培养3～7 d，观察计数并计算单位质量干土细菌和真菌的数量。
　　1.2.3 灭菌次数对土壤pH值和EC值的影响 根据鲍士旦等的方法[16]，分别取不灭菌（CK）、灭菌1次（CS1）、灭菌2次（CS2）、灭菌3次（CS3）土壤各5 g溶于25 mL无菌蒸馏水（土水比1 ∶5）中，充分混匀后分别用pH计（S20，梅特勒-托利多仪器有限公司）和电导率仪（FE30，梅特勒-托利多仪器有限公司）测定pH值和EC值。 　　1.2.4 土壤灭菌次数对黄瓜幼苗生长的影响 2014年11月30日播种育苗，子叶展平时定植于装有上述不同处理土壤的营养钵（8 cm×8 cm）中，每钵200 g土、1株黄瓜幼苗。每个处理30次重复，共120钵。于东北农业大学园艺站人工气候室培养，光照时间和湿度设置：光照时间12 h/d（6：00―20：00），光照度为7 000 lx；湿度为75%。每2 d每钵定量浇50 mL无菌水。不使用杀菌剂和杀虫剂。为了消除光照造成的误差，定期调换幼苗的位置。
　　在定植20 d（2叶1心期）和40 d（4叶1心期）时取样，每个处理分别随机选10株黄瓜幼苗测定株高和地上部鲜质量。
　　2 结果与分析
　　2.1 灭菌次数对土壤细菌和真菌数量的影响
　　高压蒸汽灭菌能有效杀死土壤中的微生物。由表1、图2可见，与对照相比，灭菌1次（CS1）可以有效地杀灭土壤中的真菌，且培养3、4 d的平板都未见真菌菌落出现，说明灭菌1次即可杀灭土壤中的真菌；但是对于细菌，灭菌2次后还有大量的菌落出现，直到灭菌3次才未见菌落出现。
　　2.2 灭菌次数对土壤pH值和EC值的影响
　　由图3可以看出，未灭菌的土壤pH值显著低于灭菌土壤，但是灭菌不同次数的土壤其pH值变化不显著；土壤EC值随土壤灭菌次数的增加而升高，但是灭菌2、3次的EC值差异不显著。
　　2.3 灭菌次数对黄瓜幼苗生长的影响
　　黄瓜幼苗定植40 d的生长情况见图4。本研究中未灭菌土壤种植的黄瓜幼苗在20、40 d时地上部鲜质量和株高均显著高于灭菌土壤；与对照相比，随着灭菌次数的增加，在20 d时，黄瓜幼苗的地上部鲜质量分别减少了25%、49%和52%，株高分别降低了13%、27%和29%，但2次灭菌和3次灭菌差异不显著；在40 d时，黄瓜地上部鲜质量分别减少了25%，60%和63%，株高分别降低了24%、37%和40%，但2次灭菌和3次灭菌差异不显著。
　　3 讨论与结论
　　高压蒸汽灭菌是在较高的温度和气压下进行的，势必会对土壤的理化性质产生影响，进而影响植物的生长。Mahmood 等用121 ℃高压蒸汽对土壤灭菌1 h，显著提高了土壤的电导率[3]，和本试验结果一致。李会娜等用高压蒸汽灭菌3次的菜园土培养紫茎泽兰，发现紫茎泽兰的株高和生物量显著低于对照处理（未灭菌）[12]。梁智等用高压蒸汽灭菌的土壤种植棉花，使棉花株高降低12.7%，地上部干物质质量减少66.7%，地下部干物质质量减少44.5%[13]。
　　在本试验中，利用高压蒸汽灭菌器，在121 ℃（0.1～0.2 MPa）条件下灭菌，每次灭菌30 min，灭菌1次就能消除土壤中的真菌，而消除细菌则需要灭菌3次。灭菌次数越多必然使灭菌效果更好，但是不可避免地会对土壤的理化性质造成影响。与未灭菌的土壤相比，灭菌显著提高了土壤的pH值和EC值，但是灭菌2次和灭菌3次后这2个指标没有显著变化。同样，从对植物生长的反馈结果来看，几次灭菌的土壤均显著抑制了黄瓜幼苗的生长，但是灭菌2次和3次的土壤对黄瓜幼苗生长的影响则不显著。因此，如果想消除土壤中的真菌，只要灭菌1次即可；而要消除所有的微生物，则最好灭菌3次。
　　参考文献：[HJ1.66mm]
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