菱形藻HE06产二十碳五烯酸培养条件优化

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　　摘要：二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）对缓解心律不齐、高血压等疾病具有重要作用，对调节情绪、治疗风湿性关节炎及哮喘也具有积极意义。通过优化氮源和碳源、添加生长因子等途径提高菱形藻HE06的EPA产率。经优化得到硝酸钠、氯化铵、尿素、维生素B1、维生素B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氢钠的最佳质量浓度分别为 75 mg/L、5 mg/L、30 mg/L、1.5 mg/L、6 μg/L、10 μg/L、1.2 g/L、2.4 g/L、1.2 g/L。在最佳优化条件下，EPA产率由最初的31.2 μg/L提升至504.8 μg/L，提高了15倍；生物量产率由19.5 mg/L提高至32.4 mg/L，提高了66.2%。
　　关键词：菱形藻；培养条件；二十碳五烯酸（EPA）
　　中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0317-04
　　收稿日期：2015-05-05
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：30960215）；广西自然科学基金（编号：桂科青0728019）。
　　作者简介：刘红全（1975―），男，黑龙江肇东人，博士，副教授，主要从事生物技术研究。E-mail：lhongquan@163.com。二十碳五烯酸（EPA）对高血压、动脉粥样硬化、血栓等心血管疾病的预防和治疗具有重大意义。在20世纪80年代前，EPA主要从鱼油中提取，由于其含量低、成分复杂等原因，致使EPA价格昂贵，难以满足人们日益增长的需求。随着微藻产EPA研究的深入，EPA的价格越来越低。微藻EPA含量高、生产条件低、提取工艺简单，已成为生产EPA极具潜力的原料来源。虽然野生型的微藻EPA含量高，但也不足以工业化生产，因此须对微藻进行生产条件优化。采用正交设计方法优化氮源、维生素、植物激素、碳源用量，从培养基优化方面提高菱形藻HE06的EPA产率。
　　1材料与方法
　　1.1仪器与藻种
　　LDZX-50 KB型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），超净工作台（苏净集团安泰公司），CFM-5002型荧光倒置显微镜（上海安捷伦公司），LRH-250-GSII型人工气候箱（广东省医疗器械厂），Scientz-10N型冷冻干燥机，GC20-14B型气相色谱。
　　藻种HE06由笔者所在实验室分离自广西壮族自治区钦州市茅尾海自治区级红树林保护区，经鉴定为菱形藻属。该藻培养于f/2培养基中，人工气候箱的培养条件为光照度 4 000 lx、暗光比12 h/12 h、温度（24±1）℃、湿度40%。
　　1.2生长条件优化
　　于500 mL锥形瓶内装入180 mL液体培养基，按照10%的接种量在超净台中接种对数期藻种。
　　1.2.1氮源优化分别以f/2原培养基中氮源物质的量为中间点，向左右延伸2个质量浓度，分别设置硝酸钠单因素优化质量浓度。分别设置硝酸钠的质量浓度为55、65、75、85、95 mg/L；分别设置氯化铵的质量浓度为35、41、47、53、60 mg/L；分别将尿素的质量浓度调整为10、20、30、40、50 mg/L。氮源的正交试验选用最佳硝酸钠、氯化铵、尿素单因素优化值及其左右邻值进行4因素3水平正交试验优化。
　　1.2.2维生素优化维生素的质量浓度参照f/2培养基的质量浓度进行设置。生物素的质量浓度分别为0.5、1.0、20、4.0、8.0 μg/L；维生素B1的质量浓度分别为0.05、0.10、020、0.40、0.80 mg/L；维生素B12的质量浓度分别为025、050、1.00、2.00、4.00 μg/L。维生素的正交试验选用最佳生物素、维生素B1、维生素B12单因素优化值及其左右邻值进行4因素3水平正交试验优化。
　　1.2.3植物激素优化IAA的质量浓度分别为0.5、1.0、20、4.0、8.0 mg/L；6-BA、赤霉素的质量浓度分别为0.2、04、0.6、0.8、1.0 mg/L。植物激素的正交试验选用最佳IAA、6-BA、赤霉素单因素优化值及其左右邻值进行4因素3水平正交试验优化。
　　1.2.4碳源优化葡萄糖的质量浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L；甘油的质量浓度分别为0.3、0.9、1.8、2.7、3.6 g/L；碳酸氢钠的质量浓度分别为0.3、0.9、1.8、2.7、3.6 g/L。碳源的正交试验选用最佳葡萄糖、甘油、碳酸氢钠单因素优化值及其左右邻值进行4因素3水平正交试验优化。
　　1.3生长速率的测定
　　将所有培养体系置于人工气候箱中，于2 d时开始测定培养体系的D680 nm，此后每天在规定时间测定1次D680 nm。当培养体系的D680 nm在3次测定内无变化时，将 100 mL 藻液倒入250 mL离心瓶中，于6 000 r/min离心 10 min 收集藻液，将沉淀转移至10 mL带螺旋盖的离心管中，用去离子水洗涤离心2次并冷冻干燥。干燥后的藻粉直接保存于-20 ℃冰箱中。微藻的比生长速率μ按照如下公式[1]进行计算：
　　μ=ln（Nt/N0）/（Tt-T0）。
　　式中：Nt为稳定期悬浮藻液在680 nm处的吸光度；N0为接种后2 d悬浮藻液的D680 nm；Tt为进入稳定期的时间（d）；T0为接种后2 d的时间（d）。
　　1.4不饱和脂肪酸的提取及测定
　　脂肪酸的提取及甲酯化方法参照文献[2]。将50 mg干燥粉置于带螺旋盖的离心管中，加入混合溶液（三氯甲烷 ∶ 甲醇 ∶ 水=2 ∶ 1 ∶ 0.8）并充入N2 1 min，以80 W超声20 min后于 75 ℃ 水浴15 min，冷却后以4 000 r/min离心10 min，取三氯甲烷层；重复以上步骤2次，合并三氯甲烷层，加入等体积混合溶液（甲醇 ∶ 氢氧化钠=2 ∶ 1）并充入N2 1 min，以 80 W 超声 20 min 后于75 ℃水浴15 min，冷却后以4 000 r/min离心 10 min，取上清并加入500 μL正己烷萃取30 min。 　　对Liang等的EPA气相色谱测定升温程序[3]稍作改进，初温72 ℃保持1 min，以30 ℃/min升温至150 ℃并保持 1 min，再以5 ℃/min升温至250 ℃并保持5 min。进样口、检测器的温度均为280 ℃。载气为高纯度氮气，流速为 30 mL/min，进样量为1 μL。
　　2结果与分析
　　2.1生长速率
　　由图1、表1可知，在正交优化的4组试验中，进入稳定期的时间均延后。其中，氮源、维生素、植物激素试验组进入稳定期的时间延后至10 d；而碳源试验组进入稳定期的时间延后最长，达到15 d。所有试验组的D680 nm均有所提高，激素正交优化组的D680 nm与前一优化组（维生素组）相比有所下降，表明植物激素正交试验对菱形藻HE06具有抑制作用，而氮源、维生素试验组基本无变化。维生素试验组进入对数期较快，氮源试验组适应期较长。比生长速率测定结果显示，氮源与维生素培养优化中的比生长速率最高，而碳源组与对照组相比基本无变化。
　　2.2优化结果
　　单因素优化结果（表2）显示，单独添加氯化铵、尿素均能提高菱形藻HE06的EPA含量，EPA含量分别达到0.234%、0.219%，与硝酸钠作为氮源相比分别增加了45.3%、360%。但在单因素优化中，其生物量产率均有所下降，而在随后多种氮源正交优化中，与未优化对照组相比，生物量产率增加了19.0%，EPA产率增加了 161.5%（图2-b）。可见，硝酸钠、尿素、氯化铵的正交优化更有利于菱形藻EPA的积累。在使用质量浓度方面，三者在正交优化的使用质量浓度均有所回落，其中氯化铵的变动最大，变为5 mg/L，尿素下降了 10 mg/L，硝酸钠回到f/2的使用质量浓度。
　　表2、图2-e表明，菱形藻经过维生素正交优化后，生物量产率提升22.4%，EPA产率提升206.0%，与氮源正交优化结果类似，均能有效提高EPA产率，且对生物量的影响不大。在使用质量浓度方面，维生素B1、B12、生物素的使用质量浓度分别上升了0.9、2.0、4.0倍，与氮源优化结果相反。在仅有维生素B1、维生素B12、生物素的培养基中生物量产率低下，分别为6.5、8.9、15.9 mg/L。
　　在植物激素正交优化中，不仅生物量产率没有得到提升，EPA产率也有所下降（图2-c），表明对菱形藻HE06而言，IAA、6-BA、赤霉素的正交并不适于其生物量、EPA产物的积累。在单因素优化中，仅加入IAA对生物量产率具有促进作用，而6-BA、赤霉素均表现出抑制作用。
　　碳源正交试验中，在使用质量浓度方面，除碳酸氢钠不变以外，葡萄糖、甘油的使用质量浓度均有所上升。生物量产率由维生素试验组的28.4 mg/L上升至32.6 mg/L，仅提高了14.8%。气相色谱测定结果（图2）显示，在21.9 min左右出现1个较大的峰值，表明EPA产率得到极大提高，达到 503.9 μg/L，与维生素试验组相比提高了101.8%。4个试验组中氮源、维生素、植物激素、碳源的添加对菱形藻HE06的总脂组分影响均不大，EPA含量主要随总脂含量的升高而升高。
　　3结论与讨论
　　经优化得到硝酸钠、氯化铵、尿素、维生素B1、维生素B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氢钠的最佳质量浓度分别为75 mg/L、5 mg/L、30 mg/L、1.5 mg/L、6 μg/L、10 μg/L、1.2 g/L、2.4 g/L、1.2 g/L。在该条件下，EPA产率为 504.8 μg/L，提高了15倍；生物量产率为32.4 mg/L，提高了66.2%。本研究同时添加3种氮源，不仅促进了菱形藻HE06生物量的增加，也促进了微藻EPA产量的积累。氨存在于所有细胞器中，微藻对氨态氮的吸收不仅受到环境中氨浓度的影响，还受到环境pH值、光照条件、自身对氮源的需求、环境中硝酸盐浓度的影响[4]。微藻对氨的持续吸收使环境中的pH值下降，pH值持续下降导致微藻更倾向于吸收硝酸盐，从而使环境中的pH值上升。环境中质子浓度的升高对藻细胞具有毒性作用，这种作用可在一定程度上促进产物的积累，而高浓度的质子能够破坏膜系统从而导致细胞死亡[5]；因此，在单因素优化中，最佳氨浓度下菱形藻HE06的生物量产率不高，而EPA含量却有所增加。铵离子的存在还会抑制微藻对环境中硝酸盐的吸收，因此氮源正交优化中微藻对氮源的吸收下降[6]，使用氨态氮作为氮源时必须使培养基中的pH值条件保持稳定[7-8]。本研究中菱形藻HE06氨的单因素优化在三角锥形瓶中进行，没有持续控制培养基的pH值，因此生物量产率较低。微藻对硝酸盐的同化吸收过程须消耗大量的能量和质子，使pH值上升，与氨的同化作用相反[9]。微藻对尿素的同化作用主要依靠脲酶或尿素氨基水解酶催化完成，这2种酶在微藻细胞内的活性均不高；因此，在尿素单因素培养中，菱形藻HE06的生物量产率也较低[10]。在三者的正交试验中，微藻先后对氨、氮的吸收维持了培养基的pH值平衡，而培养基中不断变化的pH值刺激了微藻总脂的积累，从而促进EPA的积累。
　　目前，维生素在微藻内的合成代谢过程尚不明确，研究表明，其更多作为乙酰辅酶A羧化酶、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等酶的辅因子参与微藻的新陈代谢。单因素及正交结果表明，当培养基中缺乏某种维生素时，会对微藻的生物量产率产生较大影响；当培养基中存在维生素时，其浓度对生物量的影响并不显著。维生素正交对菱形藻HE06的EPA产率影响较显著，表明向培养基中加入多种维生素能够促进某些微藻生物量及产物的积累[11]。
　　植物激素主要作为促生长因子促进微藻生长或产物的积累，而维生素作为生长因子维持微藻的基本生长需求。在菱形藻HE06的培养过程中，培养基中缺乏维生素时表现为微藻生长缓慢、生物量产率低下；而缺乏植物激素并不影响微藻的基本生长需求，反而当加入植物激素时影响微藻的生长，具有促进或抑制作用。 　　在亚心形扁藻（P. Subcordiformis）细胞内，当使用葡萄糖进行兼养时，细胞能够通过糖酵解同化葡萄糖，光合作用也在同步进行，只是光合作用的强度明显变弱[12]。对菱形藻HE06的单因素优化和正交试验均表明，这2种藻能够在有机碳源下兼养。在菱形藻HE06优化试验中，生物量产率过低归根于葡萄糖转化效率过低，这与藻种本身的特性[13]及光照度有关，过低的光照度[辐射强度低于22 μmol/（m2・s）]导致己糖转运蛋白活性过低，从而降低了葡萄糖通过细胞膜的效率[14-15]。在兼养过程中并不是碳源浓度越高、光照度越强越好；过量的碳酸氢钠会使碳酸根与碳酸氢根的离子平衡被破坏，从而形成沉淀；葡萄糖浓度及光照度的增加会抑制某些微藻的生长，同时影响总脂含量[16]。对菱形藻HE06而言，当葡萄糖浓度大于0.9时，其生物量并不随葡萄糖浓度的增加而增加[17]。对于某些种类的微藻，高浓度葡萄糖可在相当长一段时期内阻碍微藻细胞生长，此时微藻进行分批或连续培养更有优势[15，18]。微藻能够以甘油作为仅有碳源，供给能量促进微藻的生长，但当甘油作为唯一氮源时微藻的光合作用会受到甘油的抑制，从而影响微藻生长[19]。在菱形藻HE06的培养中，碳源加入后其进入稳定期均延长至15 d，这与葡萄糖浓度或甘油的加入有关[20]。在混合碳源的优化下，均能较好促进生物量生长及EPA的积累，比单独添加效果更明显。可见，通过异养获得EPA产物时，采用多种碳源正交更有利于EPA产物积累，促进碳源的利用并节省培养成本。
　　影响微藻生长及产物积累的因素多种多样，对微藻生长发育的阻碍或促进也有所差异。氮源、维生素、碳源对微藻的生物量及产物积累具有明显作用，对已知藻种进行氮源、维生素、碳源的正交优化更有利于微藻的生长及产物积累。
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