鸭疫里氏杆菌病的研究进展

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　　摘 要：通过RA病原学研究、分子生物学研究、诊断方法研究、防治研究四个方面的阐述，了解目前鸭疫里氏杆菌病的研究进展。
　　关键词：鸭疫里氏杆菌病；研究进展
　　中图分类号：S858.32 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2016）02-0043-06
　　鸭疫里氏杆菌（Riemerella Aanatipestifer，RA）病，曾名鸭疫巴氏杆菌（Pasteurella AanatiPestifer）病，是家鸭、鹅、火鸡及其它家禽和野禽的一种急性、接触性、败血性传染病，又称为新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症和鸭传染性浆膜炎。鸭疫里氏杆菌感染发病率可达10%～60%，死亡率为30%～90%，是造成养鸭业经济损失严重的传染病之一[1]。到目前为止，美国、英国、西班牙、澳大利亚、加拿大、德国、新加坡、泰国、韩国等均有本病发生。我国，1982年郭璞玉等[2]首次报道北京郊区鸭场于1980～1981年曾发生过此病，并分离到了病原菌。随后全国多个省份都相继报道了此病。
　　1 RA病原学研究
　　1.1 分类地位 1932年美国学者Henderickson和Hilbert对病原菌进行分离鉴定，并称之为鸭疫斐佛氏菌（Pfeifferella anatiestlfer）[3]。1954年Bruner和Fabricant通过比较，建议采用鸭疫莫拉克氏菌（Moraxella anatipestifer）这一名称[4]。此后，在第七版《伯杰氏细菌鉴定手册》中根据其形态与染色特性将其列入巴氏杆菌属，命名鸭疫巴氏杆菌（Pasteurella AanatiPestifer）。1991年Rossau等对原来列入巴氏杆菌属的鸭疫巴氏杆菌（Rasteorella anatipestifer，RA）与黄杆菌/噬纤维菌群的成员进行了比较研究，发现它们具有较多的相似性[5]。1993年Segers等通过分析RA的rRNA（Segers et al.，1993），进一步证实了以上观点。但由于RA在蛋白质及脂肪酸组成、培养特性、酶活性等许多方面又明显不同于黄杆菌/噬纤维菌rRNA同源群中关系较近的其他细菌，因此Segers等提出将RA归入黄杆菌/噬纤维菌rRNA同源群，并建议单列一属，称为里氏杆菌属，其代表种为鸭疫里氏杆菌，并将该菌所引起的疾病命名为鸭疫里氏杆菌病[6]。
　　1.2 血清型 目前报道鸭疫里默氏杆菌共有21个血清型[7-8]，不同血清型之间缺乏交叉保护[9]，其中鸭疫里氏杆菌2型是国内外被频繁分离到的血清型。我国许多地区都有分离到本菌的报道，张大丙等证实国内存在1、2、6、10、11、13和14共7种血清型[10]。
　　1.3 生物学特性 RA菌体呈杆状或椭圆形，偶见个别长丝状，多为单个，少数成双或链状排列。可形成荚膜，无芽孢，无鞭毛。革兰氏染色阴性，印度墨汁染色可见荚膜着色，瑞氏染色时大部分细菌呈两极着色特性[11]。韦强等通过电镜首次观察到了血清l、2型的RA的固体培养物经负染或超薄切片后可观察到约1/3的菌体具有特殊的赘生物形态结构；其内部有类似菌体的结构，有一层类似于菌体的“细胞壁”，但较薄[12]。
　　本菌在巧克力琼脂、血液琼脂和胰酶大豆琼脂中生长良好。多次继代培养可在普通培养基上生长，在麦康凯琼脂上不生长。在胰酶大豆琼脂中添加0.05%酵母浸出物，5%新生牛血清以及含有5%～10%的CO2环境可促进其生长。血液琼脂上培养24h，形成边缘整齐、透明、无色素的光滑型菌落，RA的最适生长温度是37℃。
　　本菌不同的血清型，即使同一血清型的不同菌株的生化反应也不尽相同。总的来说，不发酵葡萄糖、蔗糖，也不发酵半乳糖、乳糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和棉实糖。极少数菌株发酵麦芽糖和肌醇。硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、VP、甲基红试验、硫化氢产生、尿素分解均为阴性。氧化酶、触酶试验为阳性。多不溶血，多液化明胶[11]。
　　2 RA的分子生物学研究
　　目前，国内外学者从16SrRNA、外膜蛋白、荚膜、质粒、耐药性、致病性及相关因子等方面开展了RA的分子生物学研究。Subramandam等对4株RA编码16srRNA的基因序列的PCR产物进行序列分析，同时与产吲哚黄杆菌、粘黄杆菌等相关细菌进行了同源性分析，结果表明4株RA处于黄杆菌系统发育树上；对PCR扩增的16SrRNA基因经限制片段长度多态性（RFLP）分析表明：即使是同一血清型的不同RA菌株，16SrRNA基因仍有差异[13]。Rimler等运用DNA指纹技术进行了鸭疫里默氏菌DNA指纹图谱的研究，用限制性核酸内切酶HinfⅠ对从美国、英国、澳大利亚、加拿大、德国和以色列6个国家分离的89株RA进行了DNA指纹图谱分析，结果表明不同来源的RA其DNA指纹图谱存在明显差异，即使是同一地区同一禽类分离的RA菌株，其DNA指纹图谱也有所不同[14]。
　　Chang等对60株RA的质粒进行了分子生物学研究，发现77%的RA菌株至少带有1个质粒，60%的RA菌株含3.9kb的质粒，12%的RA菌株含6.5kb和16.0kb的质粒，5%的RA含2.0kb、16.0kb、18.0kb的质粒；23%的RA菌株不带质粒。他们挑选了3.9kb的质粒作DNA序列分析，发现G+C含量为27%，含3966bP和4个开放读码区（ORF）即vapDI、VapD2、RepAI、RepA2。RA质粒的RepA读码区的上游有一富含AT的区段，并连有4个由2lbp组成的完全重复的区段和1个由20bp组成的不完全重复的区段。对含或不含质粒的RA菌株进行VapD1序列的PCR检查，表明VapD1序列仅存在于含质粒的RA菌株中[15]。
　　目前国内外己经对RA的一些免疫原性蛋白进行了研究，苏敬良等用提纯的RA荚膜免疫7日龄北京雏鸭后，可100%抵抗同源菌株攻击[16]。程安春等对流行于我国的l、2、4和5型RA外膜蛋白多肽的组成及免疫原性进行了研究，试验结果证实1型RA的44KDa、2型的40KDa、4型的75KDa和5型的39KDa外膜蛋白是主要的免疫原蛋白[17]。Subramaniam等对RA的一种优势免疫原性OmpA的特性进行了研究，发现OmpA由外膜蛋白样结构构成的羧基端保守区和一个氨基端可变区组成，这与其他一些革兰氏阴性菌的OmpA结构相似，所不同的是RA的OmpA具有6个EF一手铐结合域和2个PEST结构域，这些基序的出现表明它们在外膜蛋白毒力方面有重要作用，而且编码外膜蛋白的基因存在于RA标准株和所有血清型参照株中[18]。 　　刘颖等用PCR技术扩增26株鸭疫里默氏菌的部分螺旋酶gyrA序列，通过与大肠杆菌（ABA36537）比较氨基酸序列找到了对喹诺酮类抗生素耐药菌株的基因突变热点和突变规律[19]。
　　Weng等报道了一个3.9kb的质粒pCFC1和一个5.6kb质粒pCFC2，分子生物学研究表明，质粒pCFC2很可能与RA的致病性相关[20]。Crasta等首次对RA的CAMP溶血素进行研究，鉴定出CAMP溶血素决定簇所需的最小DNA片段为3566bp，含一个l026bp的ORF。将CAMP基因cam经PCR扩增后克隆到E.coli M15表达CAMP溶血素，SDS-PAGE和Western-blot分析证实了重组菌表达一种37KDa的蛋白，该蛋白具有免疫原性，能协同其它细菌产生溶血作用，可能与致病性有关[21]。
　　3 RA诊断学研究
　　3.1 RA的流行病学研究 本病主要感染家鸭，曾有报道鹅、火鸡自然暴发鸭疫里默氏杆菌病，从雏鸡、珍珠鸡、鹤鹑、澳州长尾锥和其它水禽中也曾分离到鸭疫里默氏杆菌。1～8周龄的鸭都易感，但尤以2～3周龄的小鸭最易感。
　　本病一年四季均可发生，但以冬春季发病最多。可通过污染的饲料、饮水、飞沫、尘土经呼吸道、消化道、刺破的足部皮肤的伤口、蚊子叮咬等多种途径传播，库蚊是RA的重要传播媒介。本病潜伏期的长短与菌株的毒力、感染途径以及应激等因素有关。
　　3.2 临床诊断及病理变化 病鸭精神沉郁，食欲下降，缩头垂翅，羽毛蓬松，呼吸困难，闭目，眼鼻分泌物增多，呼吸困难，腿软，走动困难，多伏地。部分病鸭关节肿大，跛行或头颈扭斜，并伴有头部震颤等神经症状，扎堆，拉黄色或黄绿色稀粪。2～3d内死亡，死前出现痉挛、摇头、角弓反张等症状。病死鸭剖检发现：心包变厚，内有大量含纤维素性絮状渗出液体；心包膜和胃肠粘膜表面有厚薄不均的纤维蛋白粘附；心外膜、心冠肝、脾、胰、肌胃及肠管出血明显；肝肿大呈暗红色或土黄色，表面大小不一的坏死灶；鼻腔有多量的粘液，关节面粗糙，附有干酪样物质，关节变厚，内有大量淡红色液体；脑膜、脑组织充血、出血。
　　3.3 诊断方法研究
　　3.3.1 分离鉴定 适于分离的病料有病鸭的心血、脑、气囊、肝和病变的渗出物。根据其在普通培养基和麦康凯培养基上不生长，及其培养和生长特性、生化实验结果等可作出判定。
　　3.3.2 琼脂凝胶免疫扩散试验 琼脂凝胶免疫扩散试验（Agargeli～unodiffosion，AGID）简称琼扩试验，是在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应，可用于血清学定型，简便快捷。
　　3.3.3 凝集试验 凝集试验分为玻片凝集试验和试管凝集试验两种。应用玻片凝集试验可以实现细菌的快速鉴定，并对分离到的菌株的血清型进行大范围的粗略筛选，但要准确定型还必须依赖于试管凝集试验。试管凝集试验可以更准确的进行血清型鉴定、血清流行病学调查以及抗体效价检测。当供试菌与参照菌的凝集效价相等或仅差l个滴度时，一般可认为二者属于相同的血清型；当凝集效价相差3个或3个以上滴度时，一般可认为该二者属于不同的血清型[22]。
　　3.3.4 荧光抗体法 郭玉璞等应用直接荧光抗体法检测急性病例，涂片标本上可见黑暗的背景有带绿色荧光的菌体，本法特异性强，快而简便，效果良好[23]。朱琪等建立间接免疫荧光抗体试验，对发病小鸭的检测结果表明，鸭脑组织鼻窦及肝脏等细菌检出率较高[24]。
　　3.3.5 PCR快速检测法 胡清海等根据已发表的鸭疫里默菌15型CVLI10/89株编码42KDa主要外膜蛋白的基因序列，在国内外首次成功地建立了运用一对引物检测出不同鸭疫里默菌的PCR方法，可以用于该菌的快速诊断和快速鉴别诊断以及流行病学调查[25]。2006年曲丰发等建立了基于鸭疫里氏杆菌16SrRNA PCR检测方法[26]。2007年杨苗等根据鸭疫里氏杆菌16SrRNA基因保守序列设计特异引物建立了一种检测鸭疫里氏杆菌的PCR方法[27]。杨建远等根据GenBank中25株RA的外膜蛋白A（OmpA）基因序列，在其高度保守区设计了一对特异性引物，建立了一种检测鸭疫里氏杆菌的PCR方法[28]。2010年冯金牛等利用16SrRNA保守序列设计特异引物PCR扩增鉴定鸭疫里氏杆菌，测序结果发现其与GenBank上分布的RA的16SrRNA同源性达到99.99%[29]。
　　3.3.6 间接免疫酶组织化学法 刘维平等应用鸭源血清1型鸭疫里默菌作为抗原，免疫兔制备兔抗RA的lgG并加以纯化，建立了检测雏鸭感染鸭疫里默菌的间接免疫酶组织化学法（indirect inununo histochemical technique），在对雏鸭人工感染RA病例和疑似病例的各组织器官进行检测中发现，RA抗原分布于细胞浆、组织间隙和血液[30]。
　　3.3.7 间接ELISA法 张鹤晓等用裂解的l型RA菌体作为包被抗原，建立间接ELISA方法，检测鸭血清中抗RA抗体[31]。胡清海等用脂多糖（LPS）作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，人工感染RA的鸭在感染72h即可检出抗体[32]。程安春等用超声裂解法分别制备2型RA的裂解物包被酶标版，成功的制备了分别针对这四种血清型的ELISA方法[33]。Huang等使用一种被推测为RA表面抗原P45末端片段41KDa的重组蛋白rP45N'作为包被抗原建立的间接ELISA方法能成功的检测出1、10、15、19四种血清型的RA和ATCC11845菌株免疫鸭的血清[34]。周祖涛用大肠杆菌表达的重组蛋白OmpA建立了RA抗体OmpA-ELISA检测方法，试验结果证实能够应用于临床RA抗体检测[35]。
　　4 RA防治研究
　　加强饲养管理和环境卫生是最重要的预防措施。做好鸭舍消毒和通风，冬天要做好保暖等措施。在此基础上还包括药物防治和疫苗防治。 　　4.1 药物防治 鸭RA病药物防治主要为抗生素和磺胺类药物，但RA对抗生素的敏感性各地报道不尽相同。刘颖等对全国各地85株RA菌进行药敏检测发现，100%对氨节西林、阿莫西林等青霉毒类药物和头孢噻肟、头孢呋辛、头孢噻吩等头孢菌素类、西环素等四环素类药物敏感[36]。钟登科等[37]通过药敏试验证实鸭疫里氏杆菌1型对头孢曲松、复方新诺明高度敏感。
　　4.2 疫苗防治 由于不同血清型对异型强毒没有保护力或保护力很低，所以有必要做好RA血清型的监测工作，有利于生产出针对性强的疫苗。目前国内外RA的疫苗类型有以下几种：
　　4.2.1 RA灭活菌苗的研究 张鹤晓等用间接ELISA检测不同疫苗在免疫鸭后抗体消长规律发现油佐剂的效果最好，甲醛灭活苗二次免疫次之，甲醛灭活苗一次免疫效果最差[31]。黄渝等比较了灭活铝胶苗、灭活蜂胶苗以及灭活油乳剂苗的免疫效果，结果表明三种不同佐剂菌苗的保护效果逐渐增强，但同时这三种佐剂的副作用也逐渐增加[38]。
　　4.2.2 RA弱毒活菌苗的研究 Sandhu等选择1、2、5型的RA自然弱毒株，并经鸭体回传10代无毒力返强，用这些弱毒株研制了三价活毒苗，经饮水和气雾免疫1日龄雏鸭，对攻毒和野外感染均有较好的保护效果[39]。Higgins等在研究不同RA疫苗的免疫应答机制时，选用分离的1型RA野毒株，经连续62代的肉汤和血琼脂培养基传代，筛选出弱毒株，通过皮下注射、气雾和饮水途径免疫雏鸭，应用ELISA技术检测血清抗体，通过淋巴细胞转移实验（LTT）研究其细胞免疫应答，结果该弱毒菌苗不仅产生长时间高水平抗体，而且引发了较强的细胞免疫应答[40]。
　　4.2.3 亚单位疫苗 林世棠等也对亚单位成分（荚膜和外膜蛋白）进行了提取并测定其免疫原性，结果表明RA亚单位成分免疫保护效果与提取物中的蛋白浓度呈正相关[41]。Pathanasophon用1、19型RA培养基无细胞滤液（Cell-free CultureFiltrate，CCF）免疫雏鸭后能很好地抵抗同型菌株的攻击，CCF制作的疫苗有免疫原性，可能是滤液中的亚单位成分在发挥作用，因为RA在培养过程中有部分荚膜要分离菌体[42]。苏敬良采用十六烷基二甲醛澳化按（CTAB）提取出1型RA的荚膜成分，其粗提物与纯化物免疫雏鸭后对同型菌株的攻毒保护率分别为90%和70%[43]。吕敏娜等证实，主要成分为蛋白质多糖复合物的可溶性荚膜抗原较全菌灭活苗有着更好的免疫效果[44]。苏敬良等提取了l型RA的OmpA，通过研究也证明RA外膜蛋白是具有良好免疫保护效果的一种亚单位成分[45]。
　　4.2.4 改进的液体培养和鸭胚培养工艺苗 鲍国连等用从浙江省发病鸭厂病死鸭中分离鉴定的RA-J、RA-L菌株研制疫苗，采用改进的液体和鸭胚培养工艺进行增菌培养，制备的疫苗有较高的保护率。另外，他们还发现疫苗中加入左旋咪唑作为免疫增强剂，可促进外周免疫活性细胞功能，诱导早期T细胞分化成熟，促进淋巴因子产生，从而增强免疫功能[46]。
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　　Abstract：By etiology， molecular biology， diagnostic methods， revention research of RA described in four areas， understand the current duck anatipestifer disease research.
　　Key words：Riemerella anatipestifer； Research
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