甘蓝型油菜心叶颜色性状的遗传和AFLP标记的筛选

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　　摘要：在油菜育种过程中往往会应用到一些指示性状，旨在研究甘蓝型油菜心叶颜色遗传规律、筛选扩增片段长度多态性（AFLP）标记。通过遗传分析可知：甘蓝型油菜的紫色心叶性状受1对显性基因控制，心叶紫色对心叶绿色呈显性。用心叶紫色甘蓝型油菜、心叶绿色甘蓝型油菜构建F2、BC1分离群体，通过AFLP、BSA相结合的方法共从512对引物组合中筛选到6个与心叶紫色连锁的AFLP标记。
　　关键词：甘蓝型油菜；心叶紫色；遗传规律；AFLP
　　中图分类号： S634.303.2
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2016）04-0090-03
　　油菜作为世界四大油料作物之一，在我国的种植分布很广泛，同时在人们的日常生活中担当很重要的角色[1]。在油菜的各个生长过程中会出现不同的性状遗传，其中出现在苗期的有紫红色心叶、紫色真叶、紫色幼茎、花叶、刺毛等[2]，前三者作为指示性状最方便，于幼苗早期（即出现1～5张真叶时）就能判断是否为真杂种，可在幼苗早期拔出杂株，从而大大加快选择效率。作为具备理想指示性状的材料还需具备1个必备条件――该性状受环境影响小，且表现稳定，群体整齐一致，不出现农艺性状和标记性状分离的情况[3]。目前，已有育种单位选育出双低甘蓝型紫红叶油菜材料[4]。
　　在植物生长过程中，在不同阶段所合成的叶绿素、叶黄素、胡萝卜素和花青素的量是不相同的，也正是这个原因，叶绿体中色素、液泡中色素的呈比例变化给我们呈现出不同的颜色。在紫叶李等一些植物的叶片中，由于液泡中花青素的含量比叶绿体内色素的含量高很多，叶片才表现出花青素的本色――红色[5]。也有研究表明：花色素苷的合成对于植物叶片颜色起到至关重要的作用。花色素苷普遍存在于植物的各个部位，如花、果实、茎、幼苗甚至根中，主要分布于表皮细胞中。花色素苷对植物适应环境的意义主要表现在提高光保护能力、提高抗旱能力以及提高抗冻能力[6]。
　　有关油菜叶色的遗传分析最早可以追溯到1954年，Singh研究表明，芥菜型油菜紫叶性状是由1对显性基因控制的，紫叶对绿叶为显性。Dixit等于1972年发现，芥菜型油菜的叶缘粉红色性状受1对显性基因控制。1971年，Stringam等对白菜型油菜的红色茎秆性状进行研究表明，该性状同样受1对显性基因控制。近些年来，国内对甘蓝型油菜叶色的研究也较多，但大都停留在基础的遗传分析上。贵州农学院在1978年对部分甘蓝型油菜紫色心叶的材料研究发现，该性状是受1对显性基因控制的，紫色心叶对绿色心叶为显性。吴新杰等提到，莫鉴国于1992年发现，甘蓝型油菜的紫叶性状是不完全显性遗传，紫叶亲本和绿叶亲本杂交后，F1代出现了中间类型[7]。黄泽素等于2006年发现，他们所获得的紫红叶甘蓝型油菜的紫红色受1对显性基因控制[8]。涂金星通过对随机扩增多态DNA（RAPD）分子标记研究发现，紫秆与可育基因Ms1存在连锁关系，交换值范围为1.95%～850%[9]。吕九龙等在研究甘蓝型叶色基因时采用扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记与BSA相结合的方法，共找到2个与紫叶基因Pur连锁的标记，且位于基因两侧[10-11]。
　　本研究所用的具有心叶紫色甘蓝型油菜材料是经过多代自交获得的已稳定的材料，且该性状只是出现在幼苗早期，与那些将紫叶作为标记性状的材料相比对产量的影响要小。本研究主要目的是：通过观察田间性状表现，确定心叶紫色的遗传规律；通过采用AFLP与BSA相结合的方法找到与紫色心叶GZX基因紧密连锁的分子标记，为进一步克隆该基因打好基础，进而能够应用于分子辅助选择育种中，加快育种进程。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与群体构建
　　4351、4361为心叶绿色亲本，3230为心叶紫色亲本（且紫色只在幼苗早期表现）由青海省农林科学院春油菜研究所提供，2个亲本均经过多代自交（6代以上），心叶颜色稳定遗传。
　　分别用4351、4361与3230进行杂交（同时反交）。获得的F1代单株与心叶绿色亲本进行回交，构建BC1分离群体。同时将F1代中的部分心叶紫色单株套袋自交，获得F2代分离群体。
　　1.2 心叶颜色遗传规律的确定
　　于幼苗早期（1～5张真叶）在田间调查心叶紫色、心叶绿色单株的分离比，共设2个杂交组合，用卡方测验来检验分离比，确定其遗传规律。
　　1.3 DNA的提取及样品池的构建
　　在油菜苗期，先挂牌，后在每个单株上取2～3 cm2新鲜嫩叶，用CTAB法提取叶片总DNA[12]。DNA浓度用紫外分光光度计测量，然后用TE缓冲液稀释至50 ng/μL，-20 ℃保存备用[13]。
　　根据幼苗早期心叶颜色的鉴定结果，分别随机选取12个紫色心叶单株、12个绿色心叶单株，将其DNA分别等量混匀，构成2个心叶紫色基因池、2个心叶绿色基因池。
　　1.4 AFLP分子标记的筛选
　　酶切组合为PstⅠ+MseⅠ，AFLP引物和接头由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。预扩增所采用的引物组合为 P0/MG、P0/MC，以稀释30倍的预扩增产物作为选择性扩增的模板，随后选择性扩增的产物通过6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳检测[14]。
　　1.5 差异片段回收、克隆和测序
　　将AFLP差异性片段从6% PAGE胶板上挖出并转入1.5 μL 离心管中，加入30～50 μL ddH2O并用一次性无菌枪头捣碎，于沸水中煮10 min后于4 ℃离心备用。吸取2 μL上清液作为模板，用原对应引物重新进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，后用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收主带。用纯化后的目标片段与 pMD18-T载体（TaKaRa）连接，随后将连接液导入DH5α大肠杆菌感受态细胞中进行培养。于培养液中加入约300 μL的LB液体培养基（未加Amp），150 r/min温和摇振60 min。将200 μL转化液均匀涂布于含有Amp的LB固体培养基上培养，倒置过夜，挑选单克隆菌斑于500 μL LB液体培养基（含Amp）中培养。随后对菌液进行PCR检测，将得到的阳性克隆片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。具体过程参考李霞的方法[15]。 　　1.6 AFLP特异片段的序列分析
　　将筛选得到的与心叶紫色紧密连锁的标记相应的序列信息提交到NCBI数据库中进行Blast同源比对分析。选取比对结果中一致性高且E值小于10-7的同源位点，比较标记位点与甘蓝型油菜同源位点间的关系。
　　1.7 遗传连锁图谱的构建
　　将所获得的AFLP标记在BC1分离群体中统一进行单株检测。为了便于单株基因型的确定并找出交换单株，在进行群体检测时将心叶紫色的单株和心叶绿色的单株进行分组，得到基因型数据后用JoinMap 4 软件构建GZX基因所在位置的遗传连锁图谱，确定各个AFLP 标记与GZX在染色体上的遗传图距和排列顺序。
　　2 结果与分析
　　2.1 心叶紫色基因的遗传研究结果
　　由表1可知，无论是用作母本还是父本，用具有心叶紫色性状的单株进行杂交，杂种F1代均表现为心叶紫色，说明没有胞质效应，紫色对绿色为显性。从回交1代BC1、杂种F2代的表型来看：回交后代中心叶紫色与心叶绿色植株比例为1 ∶1，F2代心叶紫色与心叶绿色植株的比例为3 ∶1。综上可知，我们所获得的心叶紫色甘蓝型油菜的紫色心叶受1对显性基因控制。
　　2.2 AFLP标记的筛选
　　根据在油菜幼苗早期所鉴定的单株性状，对所有单株进行性状分组，并构建基因池。本研究选用512对AFLP选择性扩增引物（ P/MC、P/MG）。先用相对性状所构成的基因池对512对引物进行初步筛选，共选出能够区分出心叶紫色单株、心叶绿色单株的引物组合20对；将这20对引物继续在由随机选取的6个心叶紫色单株、6 个心叶绿色单株所组成的小群体中检测，在检测结果中共选出符合不超过2个重组单株标准的有6对引物，可认为是与心叶紫色基因紧密连锁的特异性标记，可用于BC1大群体中进一步筛选重组单株，分别命名为ZX1～ZX6。
　　2.3 AFLP 特异片段序列比对结果
　　将得到的6个AFLP特异片段经回收、纯化、克隆、测序后，在NCBI中进行了Blast比对，其中只有2个片段得到了一致性较高的比对结果，分别是P10MC07（比对结果表明与A05同源）、P12MG04（与A7同源），其他4个特异片段均没有比对到染色体上。
　　2.4 遗传图谱的构建
　　将在BC1群体192个单株中得到的所有检测结果（纯合记为A，杂合记为H，缺失记为“-”）导入到JoinMap4软件中，分析6个特异性标记与GZX之间的相对距离和位置关系。结果表明，ZX1～ZX5位于GZX同侧，ZX6位于另一侧；距GZX最近的标记为ZX5，遗传距离为1.5 cM；距GZX最远的标记为ZX1，遗传距离为7.8 cM；标记间最小图距为0.5 cM，最大图距为12.2 cM（图2）。
　　3 结论与讨论
　　本研究于幼苗早期（1～5张真叶）分别观察统计了2个分离群体的分离比，对统计结果进行卡方测验后得出了一致的结果：心叶紫色性状是由1对显性基因控制的，这与前人的研究结果[7]一致。但是，前人只是停留在对该性状的遗传研究层面上，并没有对该性状进行分子水平的研究，而本研究对心叶紫色性状采用分子标记的方法进行初步定位，为以后更方便地应用该性状奠定了良好的基础。
　　AFLP技术是一种检测效率高、可靠性好、重复性高、多态性高的DNA指纹技术，自1995年出现以来被广泛应用于遗传育种研究、分类和进化等方面[16]。本研究采用AFLP与BSA相结合的方法，共获得6个与心叶紫色基因紧密连锁的且分布于GZX基因两侧的AFLP标记，这为后续遗传图谱的加密做好了基础工作。
　　本研究虽获得了6个与GZX紧密连锁的AFLP标记，但只有其中2个特异片段的比对结果较好，这样一来所获得的信息不足以确定目标基因具体在哪一条染色体上，究其原因可能是所获得的心叶紫色甘蓝型油菜的遗传背景较为复杂。
　　在对GZX基因进行定位时发现，交换单株过多，会导致所得到的标记与目标基因之间距离过远。究其原因，可能是有的心叶紫色只表现在叶缘，还有一些单株的紫色褪去过早，从而导致在苗期鉴定时误把心叶紫色的单株鉴定为心叶绿色的单株，这样在进行BSA法构建基因池时，容易将性状表现模糊的单株混入，大大影响引物筛选工作的准确性，甚至根本找不到能真实显示多态性的引物。最近的研究发现，糖在花色素苷合成中可通过信号转导的方式增强一些酶的活性，以促进花色素苷的合成[17]；史宝胜等研究光照对紫叶李叶片颜色的影响发现，充足的光照可以提高叶片中的碳水化合物含量，从而可以显著促进花色素苷的合成，使叶片的紫色更加鲜艳[18]。因此本研究提出以下建议：最好在日照充足、心叶紫色性状表现充分的时候进行鉴定，从而为后期的性状分组、基因定位打好基础。
　　甘蓝型心叶紫色油菜作为一种特殊的资源，在应用研究中可以将控制心叶紫色的基因导入到不育系材料中，这样在苗期就能将母本中的杂株拔出，大大提高种子的纯度；在测定一些品种或品系的自然异交率时，得到的后代中凡是带有心叶紫色性状的单株都属于真杂种，这样就能比较容易且准确地得到该品种的异交率；鉴于本研究的试验材料具有只在苗期出现且只有心叶为紫色的特点，可以将其当作一种观赏性的油菜，结合合理布局，能够创造出一种特殊的视觉效果，从而为当地旅游增加新的创收点。
　　在苗期进行心叶颜色调查时发现，2个杂交组合F1代所表现的紫色的程度有所不同，导致这种现象的内在原因在本研究中没有涉及，下一步试验将会着重探究。考虑到调查心叶紫色性状分离时所遇到的困难，下一步将会重点研究影响心叶紫色性状表现的因素，从而为提高鉴定性状的准确率提出较为合理的策略。
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