外源Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同工酶的影响

来源:用户上传      作者:

　　摘要：以金线兰组培苗为材料，采用分光光度法和同工酶电泳技术研究了外源Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同工酶的影响。结果表明：不同浓度的Ca2+处理能够使金线兰SOD、CAT、POD、APX活性呈现一定的升降变化，其中SOD酶活呈“M”形的变化趋势，CAT酶活呈先升后降的趋势，APX酶活在较高浓度的Ca2+处理下较其他酶慢，POD变化范围较大；同工酶分析发现，不同浓度的Ca2+处理，在一定时间范围内可诱导产生新的POD和APX酶带表达，而不诱导新的SOD和CAT酶带的表达。
　　关键词：金线兰；Ca2+；抗氧化酶；同工酶
　　中图分类号： S682.310.1
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2016）04-0229-04
　　金线兰（Anoectochilus roxburghii （Wall.）Lindl），兰科开唇兰属的一种多年生草本植物，具有极高的药用价值，且株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是一种观赏价值极高珍品，具有广阔的开发利用前景。但由于金线兰的自身抗性较差，对环境要求极高，以至于其资源的开发利用受到限制。Ca2+不仅是植物必需的营养元素，同时也是细胞信号转导过程中重要的第二信使，与植物的抗氧化酶系统密切相关，通过调节相关抗氧化酶活性提高植物对逆境的适应能力[1-2]。关于金线兰的报道多集中在组培和胁迫相关的生理响应机制研究[3-7]，而作为重要的信号转导物质，Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及同工酶影响的研究未见报道。因此本试验对金线兰组培苗进行不同浓度的Ca2+处理，测定SOD、POD、APX、CAT的活性，同时对同工酶进行研究，探讨信号物质Ca2+对抗氧化酶的活性及同工酶的影响，为Ca2+与抗氧化酶系统关系研究提供一定基础，为金线兰抗逆机理研究提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料的培养
　　试验材料金线兰组培苗由贵州师范大学金线兰课题组提供。将处于增殖期且生长时间一致的金线兰组培苗转接到生根培养基中，培养60 d后，选取长势一致的生根组培苗，备用。培养条件：光照12 h/d，光照度2 000 lx，温度（21±2） ℃。
　　1.2 材料的处理
　　取已经生根的金线兰组培苗，分别在添加0.5、1.5、2.5 mmol/L CaCl2的MS培养液中处理6、12、24、48、72 h，对照（CK）为MS培养液处理。
　　1.3 测定方法
　　1.3.1 粗酶液的制备 参照王爱国等的方法[8]制备粗酶液：金线兰成熟鲜叶去掉主脉，准确称取1 g，加入5 mL预冷的酶提取缓冲液，冰浴充分研磨，于低温离心机12 000 r/min 离心20 min，上清液即粗酶液，冷藏备用。
　　1.3.2 酶活测定 SOD活性测定：参考王爱国等的方法[8]稍作修改，先加入150 μL粗酶液，然后依次加入2.7 mL 14.5 mmol/L 的L-甲硫氨酸，0.1 mL 3 mmol/L EDTA，0.1 mL 2.25 mmol/L NBT和0.1 mL 60 μmol/L 核黄素。混匀后倒入比色杯，在3 000 lx下光照10 min，反应后立即避光，将反应液颠倒几次混匀后立即测D560 nm值，以不加粗酶液而加酶提取液为最大光还原管，以PBS液代替NBT作为空白，以能抑制NBT光化还原50%为1个酶活力单位U，酶活力按下式计算，单位为：U/g。
　　计算公式：
　　反应抑制率 =（对照D560 nm-对照空白D560 nm）-（样品D560 nm-样品空白D560 nm）（对照D560 nm-对照空白D560 nm）×100%；
　　酶活力（U/g）=反应抑制率50%×3 mL反应混合液中加入的样量。
　　POD活性测定采用愈创木酚法[9]。3 mL反应混合液（500 mL 50 mmol/L PBS pH值7.8+0.28 mL愈创木酚+0.19 mL 30%H2O2）中加入50 μL酶液，迅速摇匀立即测D470 nm，每30 s读数1次，以1 min D470 nm升高0.1的D值为1个酶活力单位U，单位为U/（min・g）。
　　APX活性测定参照Dalton等的方法[10]，略作改进。3 mL反应混合液（50 mmol/L PBS pH值7.0+0.1 mmol/L EDTA-Na2+0.5 mmol/LAsA，10 mmol/L H2O2）加入100 μL粗酶液启动反应，连续记录D290 nm，10 s 读数1次，以1 min D290 nm降低0.1的D值为1个酶活力单位U，单位为U/（min・g）。
　　CAT活性测定参照程鲁京等的钼酸铵显色法[11]，略作改进。所有药品在室温下恒温，然后在空白管（B2）加 1 mL 65 μmol/L H2O2基质液，空白管（B3）中加入1 mL 60 mmol/L PBS缓冲液（pH值为7.4），空白管（B1）中加1 mL 65 μmol/L H2O2 基质液，样品管（U）中加0.2 mL粗酶液和 1 mL 65 μmol/L H2O2基质液，37 ℃水浴保温1 min后加入 1 mL 32.4 mmol/L 钼酸铵溶液，混匀后在B2管和B3管分别加入0.2 mL 60 mmol/L 钠-钾磷酸盐缓冲液（pH值7.4）；在B1管加入0.2 mL粗酶液。5 min后于405 nm处以蒸馏水调零比色，记录吸光度（D）。酶活力以清除H2O2 的mg数表示，按下式计算，单位为mg/（min・g）。
　　酶活力[mg/（min・g）]=DB1-DUDB2-DB3×65×1×340.2×0.2×1 000。
　　1.3.3 同工酶分析 分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为 2.5%，pH值为8.3的Tris-Gly电极缓冲液。上样量为40 μL。电泳开始时，电流设为10 mA，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后，调电流至15 mA。电泳时间视酶分子量而定，一般至指示剂距凝胶前沿1 cm为停止时间。 　　1.3.3.1 加样 浓缩胶聚合完成后，缓慢拔出样品梳，注入预冷已稀释10倍的电极缓冲液。用微量进样器吸取40 μL处理后的酶液（10 μL酶液、20 μL 40%的蔗糖溶液、10 μL 2%的溴酚蓝指示剂），依次加入加样槽中。
　　1.3.3.2 酶活性染色 SOD活性染色：参照文献[12]的方法，略作改进。电泳结束后，将胶浸泡于染色液 2.45 mmol/L NBT中，避光浸泡20 min，并不时摇动，蒸馏水漂洗，再放入0.036 mol/L（pH值 7.8）磷酸缓冲液（含0.028 mol/L TMEDA，28 μmol/L 核黄素），避光浸泡15 min，并不时摇动，蒸馏水漂洗，放入0.05 mol/L PBS（含0.1 mmol/L Na2-EDTA）（pH值7.8），4 × 8 W日光灯下照光20～30 min，直至出现无色谱带，蒸馏水漂洗2～3次，拍照。
　　POD活性染色：参照Rahnamal等的方法[13]，稍作改动。染色液：0.1 g联苯胺、5 mL无水乙醇、10 mL 1.5 mol/L 乙酸钠、10 mL 1.5 mmol/L乙酸、75 mL的蒸馏水溶解并过滤待用。胶片用蒸馏水冲洗3次后，在染液中加入0.14 mL 30%H2O2，迅速摇匀后将胶片放入，待酶带完全出现后（约20 min），用自来水冲洗2～3次，拍照。
　　APX活性染色：采用抗坏血酸――联苯胺染色法。染色液成分为：AsA 70.4 mg、联苯胺溶液（2 g联苯胺溶于18 mL温热冰醋酸中，再加入蒸馏水72 mL）20 mL、1.2%H2O2溶液20 mL、蒸馏水60 mL。蒸馏水润洗胶片2次，再加入40～50 mL 的染色液，直到清晰的APX带显现为止，将染色液倒掉，并用自来水冲洗几次，照相。
　　CAT活性染色：参照Woodbury等的方法[14]，电泳结束后，用蒸馏水清洗胶片，0.05%H2O2溶液浸泡20 min后用蒸馏水冲洗几次，再加入染色液（含有0.5%的氯化铁，0.5%的铁氰化钾），直到显带为止，照相，整个过程注意避光。
　　2 结果与分析
　　2.1 外源Ca2+对金线兰抗氧化酶活性的影响
　　2.1.1 Ca2+对金线兰SOD活性的影响 3种浓度的Ca2+处理对金线兰SOD酶活性的影响见图1，可以看出SOD酶活性呈现“M”形的变化趋势，即先升高后降低再升高，最后趋于稳定。其中，1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 处理下SOD酶活性都在24 h达到最大值，而0.5 mmol/L Ca2+处理下在48 h时达到最高值。由此可知，外源钙处理能提高SOD酶活性。
　　2.1.2 Ca2+对金线兰POD活性的影响 3种浓度的Ca2+处理下金线兰POD酶活性的变化情况见图2，0.5 mmol/L和 1.5 mmol/L Ca2+处理下，POD酶活性变化呈现先升高后下降再升高的趋势，在2.5 mmol/L Ca2+处理下，呈现先下降后升高的趋势，可能是高浓度的Ca2+ 抑制了POD活性，一段时间适应后出现上升的变化。可知，Ca2+处理对POD酶活性影响较为明显。
　　2.1.3 Ca2+对金线兰APX活性的影响 3种浓度的Ca2+处理下金线兰APX酶活性变化情况见图3，可以看出 0.5 mmol/L Ca2+处理下APX酶活性呈现先升高后下降的变化趋势，变化不明显；1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 处理下，在12 h内APX酶活性变化不明显，而处理时间在24～72 h 时，变化较显著，呈现先下降后升高的趋势，可能是金线兰APX需要一定时间来适应较高浓度Ca2+ 的变化并作出相应的生理响应。
　　2.1.4 Ca2+对金线兰CAT活性的影响 3种浓度Ca2+处理下金线兰CAT酶活性变化情况见图4，0.5 mmol/L和 1.5 mmol/L Ca2+处理下CAT酶活性先升高后下降最后趋于稳定，且活性不同程度高于对照，2.5 mmol/L Ca2+ 处理下，在12 h内CAT酶活性变化较小，12 h以后变化较显著，呈现先上升后下降的趋势。说明在适宜的浓度范围内，Ca2+处理能有效提高CAT酶活性。
　　综上所述，SOD、POD酶活性都产生了较大的升降变化，且随着处理时间的延长趋于稳定，说明植物对外界的影响有一个紊乱调整过程；APX酶活性，在较高浓度的Ca2+处理下响应较其他酶慢；CAT活性不同程度高于对照，适当Ca2+处理能够明显提高金线兰CAT的活性且维持较高活性。其中1.5 mmol/L和2.5 mmol/L Ca2+ 处理对酶活的影响较大，0.5 mmol/L Ca2+ 处理的作用较小，其中1.5 mmol/L Ca2+ 处理24 h时金线兰抗氧化酶活性达到最高值，2.5 mmol/L Ca2+ 处理48 h次之。
　　2.2 外源Ca2+对金线兰抗氧化酶同工酶的影响
　　2.2.1 Ca2+对金线兰SOD同工酶谱的影响 金线兰经过3种浓度的 Ca2+处理后，组培苗SOD同工酶分析结果见图5，随着处理浓度和时间不同，酶带呈现一定的强弱差异，但各处
　　理和对照相比，都是共有5条带，处理后并未产生新的酶带，即没有SOD同工酶产生。
　　2.2.2 Ca2+对金线兰POD同工酶谱的影响 金线兰经过3种浓度的 Ca2+处理后，组培苗POD同工酶分析结果见图6，处理浓度和时间的不同，酶带呈现一定的强弱差异。其中，0.5 mmol/L Ca2+处理12 h和48 h时有新的酶带产生，12 h时出现1条Rf为0.137的酶带，48 h时出现2条Rf分别为0.137 和0.199的酶带；1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+ 处理后并未产生新的酶带，没有POD同工酶产生。
　　2.2.3 Ca2+对金线兰APX同工酶谱的影响 金线兰经过3种浓度的 Ca2+处理后，组培苗APX同工酶分析结果见图7，处理浓度和时间不同，酶带呈现一定的强弱差异。其中 0.5 mmol/L Ca2+处理12 h时有1条Rf为0.156的酶带产生，1.5 mmol/L和2.5 mmol/L Ca2+ 处理48 h时有1条Rf为0.156的酶带产生。 　　2.2.4 Ca2+对金线兰CAT同工酶谱的影响 金线兰经过3种浓度的 Ca2+处理后，组培苗CAT同工酶分析结果见图8，处理浓度和时间的不同，酶带呈现一定的强弱差异，但CAT同工酶带始终只有2条，各处理与对照的条带基本一致，即Ca2+处理对金线兰的CAT同工酶的表达没有明显影响。
　　3 讨论
　　关于植物抗性机理的研究已有大量报道，但由于金线兰分布范围较窄，人们多关注于金线兰的药效、组培、人工栽培等的研究[15-17]，对于其抗性研究较少。本试验就Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及同工酶的影响进行研究，探讨信号物质Ca2+对金线兰抗氧化酶的活性及表达的影响。
　　Ca2+作为第二信使，在植物的信号传递中起重要作用。关于植物逆境胁迫下钙信使和抗氧化酶系统关联的研究报道有很多[18-22]，表明外源钙处理对植株SOD、CAT、POD、APX酶活都有一个紊乱调整过程，有助于缓解胁迫的危害，这与本试验结果类似。
　　低浓度 Ca2+处理时，POD同工酶有新增酶带，高浓度时没有新增酶带，但谷俊涛等、翁笑艳等的研究结果表明Ca2+浓度越大，POD同工酶组分越复杂[1-2]，本试验结果与之有差异；同工酶电泳发现不同浓度 Ca2+处理下未产生新SOD同工酶和CAT同工酶，这与王长义等的研究结果[23]不同，可能不同植物对Ca2+的响应和调节能力存在差异，这有待进一步探讨。
　　本试验结果显示，外源Ca2+可以影响金线兰抗氧化酶活性，对APX和POD的同工酶表达有调控作用，参与了金线兰消除体内自由基的过程，推测Ca2+能够使金线兰某些特定抗氧化酶同工酶表达，从而能够激活相应保护机制，减少和缓解逆境对自身的伤害。
　　结合抗氧化酶活性与同工酶谱的分析，可以推测低浓度的Ca2+短时间（6 h）处理对同工酶的诱导作用较为明显，而较高浓度的Ca2+（1.5～2.5 mmol/L）长时间（24～48 h）处理对酶活性变化作用较大。此外同工酶的产生与酶活性变化没有明显的相关性，Ca2+不只是通过诱导新同工酶产生调节酶的活性，同时可能存在其他调节途径。
　　参考文献：
　　[1]谷俊涛，郭秀林，李广敏，等. 水分胁迫下钙、钙调素对小麦幼苗生长及过氧化物酶同工酶的影响[J]. 华北农学报，2001，16（3）：62-67.
　　[2]翁笑艳，张木清，阮妙鸿，等. 水分胁迫下钙对甘蔗幼苗抗氧化酶活性的影响[J]. 中国农学通报，2007，23（7）：273-279.
　　[3]李 光，龚 宁，周伟香，等. 外源生长物质对金线兰增殖培养的影响[J]. 贵州师范大学学报：自然科学版，2006，24（4）：9-10，108.
　　[4]周伟香，龚 宁，李 光，等. 花叶开唇兰种子非共生萌发的研究[J]. 中草药，2007，38（4）：610-613.
　　[5]周伟香，龚 宁，李 凯，等. 高温胁迫对金线兰生理特性影响的研究[J]. 贵州师范大学学报：自然科学版，2007，25（3）：25-28.
　　[6]李亚军，周伟香，龚 宁，等. 低温胁迫对金线兰抗氧化酶活性的影响[J]. 贵州农业科学，2011，36（6）：43-45.
　　[7]王定景，司庆永，龚 宁，等. 高温胁迫下外源水杨酸对金线兰抗氧化酶活性的影响[J]. 贵州农业科学，2012，40（5）：39-42.
　　[8]王爱国，罗广华，邵从本，等. 大豆种子超氧物歧化酶的研究[J]. 植物生理学报，1983，9（1）：77-84.
　　[9]张志良. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，1990：88-91.
　　[10]Dalton D A，Hanus F J，Russell S A，et al. Purification，properties，and distribution of ascorbate peroxidase in legume root nodules[J]. Plant Physiology，1987，83（4）：789-794.
　　[11]程鲁京，孟 泽. 钼酸铵显色法测定血清过氧化氢酶[J]. 临床检验杂志，1994，12（1）：6-8.
　　[12]Beauchamp C，Fridovich I. Superoxide dismutase：improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry，1971，44（1）：276-287.
　　[13]Rahnama1 H. Ebrahmzdeh H.antioxidant isozymes activities in potato plants（Solanum tuberosum L.）under salt stress[J]. Journal of Sciences，2006，17（3）：225-230.
　　[14]Woodbury W，Spencer A K，Stahman M A. An improved procedure using ferricyanide for detecting catalase isozymes[J]. Analytical Biochemistry，1971，44（1）：301-305.
　　[15]王常青，严成其，王 勇，等. 台湾金线莲多糖的分离纯化及其体外抑瘤活性研究[J]. 中国生化药物杂志，2008，29（2）：93-96.
　　[16]王建明，王松良，詹巧杰，等. 金线莲组织培养的条件优化研究[J]. 中国现代中药，2013，15（1）：45-49.
　　[17]邵清松，周爱存，黄瑜秋，等. 不同移栽条件对金线莲组培苗成活率及生长的影响[J]. 中国中药杂志，2014，39（6）：955-958.
　　[18]邹亚丽，王廷璞，呼丽萍，等. 喷施不同钙肥对苹果贮藏期间抗氧化酶活性的影响[J]. 干旱地区农业研究，2013，31（2）：186-190.
　　[19]张春平，何 平，喻泽莉，等. 外源Ca2+、ALA、SA和Spd对盐胁迫下紫苏种子萌发及幼苗生理特性的影响[J]. 中国中药杂志，2010，35（24）：3260-3265.
　　[20]李天来，张亢亢，余朝阁，等. 外源钙和茉莉酸甲酯诱导番茄植株抗灰霉病研究[J]. 西北植物学报，2012，32（3）：505-510.
　　[21]胡泽友，邓小波，彭喜旭，等. 外源钙对镍胁迫下水稻幼苗抗氧化酶活性及膜脂过氧化的影响[J]. 中国水稻科学，2007，21（4）：367-371.
　　[22]丁能飞，傅庆林，刘 琛，等. 外源氯化钙对盐胁迫下西兰花抗氧化酶系统及离子吸收的影响[J]. 中国农学通报，2010，26（6）：133-137.
　　[23]王长义，郭世荣，刘超杰. 钙对根际低氧胁迫下黄瓜幼苗根系保护酶同工酶表达的影响[J]. 西北植物学报，2009，29（9）：1874-1880. 孙 萌，吴立洁，刘海娇，等. 酚酸对三七、小麦的化感作用及其差异[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：233-236.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-11241717.htm