丹参酮ⅡA抗宫颈癌鳞癌细胞增殖效应及其雌激素受体亚型介导机制的研究

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　　摘要：目的 观察丹参酮ⅡA对宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖的影响，探讨其作用机制。方法 不同浓度丹参酮ⅡA作用人宫颈癌鳞癌Siha细胞，MTT法和流式细胞术测定Siha细胞增殖速率和增殖周期分布，Western blot测定Siha细胞磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、细胞周期蛋白（Cyclin）D表达。结果 1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA显著抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖，该抑制作用可被雌激素受体（ER）α拮抗剂MPP增强、可被ERβ拮抗剂PHTPP减弱；1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞增殖指数显著下降；1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞p-ERK、Cyclin D蛋白表达水平显著降低。结论 丹参酮ⅡA抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖是通过靶细胞ER途径实现的，并通过降低p-ERK、Cyclin D表达量发挥抗增殖作用。
　　关键词：丹参酮ⅡA；宫颈癌鳞癌Siha细胞；雌激素受体；细胞增殖；细胞周期；磷酸化细胞外信号调节激酶；细胞周期蛋白D
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.014
　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0051-05
　　Abstract： Objective To study the effects of tanshinone ⅡA on proliferation of cervical squamous cancer Siha cells； To discuss its possible molecular mechanism. Methods Cervical squamous cancer Siha cells were treated with different doses of tanshinone ⅡA. The effects of tanshinone ⅡA on proliferation of Siha cells were measured by MTT assay and flow cytometry analysis. The effects of tanshinone ⅡA on expression levels of phospho-extracellular regulate kinase （p-ERK） and Cyclin D in Siha cells were measured by Western blot. Results 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA significantly inhibited Siha cell proliferation and such effect could be enhanced by ERα antagonist MPP and attenuated by ERβ antagonist PHTPP. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6 tanshinone ⅡA could significantly decrease the proliferation index of Siha cells. 1×10-5， 5×10-6， 1×10-6， 5×10-7 mol/L tanshinone ⅡA could significantly reduce the protein expression levels of p-ERK and Cyclin D of Siha cells. Conclusion Tanshinone ⅡA can inhibit cervical squamous cancer Siha cell proliferation and such effect is realized via estrogen receptor pathway. Tanshinone ⅡA plays anti-proliferation roles by reducing the expression levels of p-ERK and Cyclin D.
　　Key words： Tanshinone ⅡA； cervical squamous cancer Siha cell； estrogen receptor； cell proliferation； cell cycle； phospho-extracellular regulate kinase； Cyclin D
　　丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神等功效。现代药理研究表明，丹参具有保护心血管、增强机体免疫功能、抗菌、抗炎、抗氧化等作用[1-2]；特别是在多个靶器官均具有抗肿瘤功效[3-4]。丹参酮ⅡA是从丹参中提取的重要脂溶性活性成分，是丹参发挥抗肿瘤作用的主要药效成分[5]。本实验前期研究表明，丹参酮ⅡA具有抗乳腺癌T47D细胞增殖的作用[6]，且经经典核雌激素受体（ER）α和β介导。近年来，宫颈癌的发生率在妇科肿瘤中明显上升[7]，丹参酮ⅡA是否具有抗宫颈癌的作用？该作用是否经ER介导？2种ER亚型在介导过程中的作用是否有差异？为了验证上述假设，本研究选取人宫颈癌鳞癌Siha细胞，探讨丹参酮ⅡA对其增殖过程的影响及其ER亚型介导途径。
　　1 实验材料
　　1.1 药物和细胞株
　　丹参酮ⅡA，中国食品药品检定研究院，纯度98%。人宫颈癌鳞癌Siha细胞，北京协和医学院细胞中心。 　　1.2 主要试剂与仪器
　　DMEM（高糖）、无酚红DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭-葡聚糖处理胎牛血清，Hyclone公司；雌二醇（E2）、MTT、DMSO、RNase、碘化丙啶、甲醇，Sigma公司；β-肌动蛋白抗体，中杉金桥公司；磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、细胞周期蛋白（Cyclin）D抗体，Santa Cruz公司；ERα、ERβ特异性拮抗剂MPP、PHTPP，Tocris公司；甘氨酸、Tween20，Amresco公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液、蛋白相对分子质量Marker、ECL超敏发光液，普利莱基因有限公司；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP，北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。CO2培养箱（Binder），酶联免疫检测仪（Epson LX-800），倒置显微镜（Olympus），凝胶成像分析仪（Pharmacia），流式细胞仪（BD）。
　　2 实验方法
　　2.1 细胞培养
　　人宫颈癌鳞癌Siha细胞常规培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培养条件为37 ℃、5%CO2及相对饱和湿度。实验开始前4 d PBS洗涤细胞2次后，改为在无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
　　2.2 MTT法测定细胞增殖速率
　　Siha细胞传代3次，经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加无血清DMEM，以细胞密度3×l03个/孔接种于96孔板，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA的DMEM培养液中继续培养，拮抗组同时加入1×l0-8 mol/L MPP或PHTPP，每种受试物均设7个复孔。48 h后加MTT（5 mg/mL、15 μL/孔），继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加DMSO 150 μL。以DMSO调零，于酶标仪570 nm处测定各孔吸光度（A）值，取其平均值，计算细胞增殖速率（实验组A值÷对照组A值）。
　　2.3 细胞周期测定
　　取经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d的Siha细胞，以5×105个/瓶密度接种于25 cm2的培养瓶中，以无血清DMEM接种24 h待细胞贴壁后，换为含1×l0-8 mol/L E2和1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA DMEM培养液中继续培养48 h后终止，获得细胞用70%冷乙醇4 ℃固定过夜，RNase处理，碘化丙啶染色，2 h内流式细胞仪检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数[（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）×100%]。
　　2.4 Western blot检测细胞磷酸化细胞外信号调节激酶、细胞周期蛋白D蛋白表达
　　细胞预处理过程同“2.3”项。药物作用48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，12 000×g离心5 min，将上清液进行蛋白含量测定后用于分析。蛋白变性后上样，SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V，分离胶120 V），半干电转膜仪转膜（80 V，75 min）。5%脱脂奶粉37 ℃振摇1 h将膜封闭；分别加p-ERK、Cyclin D、β-肌动蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗37 ℃振摇1 h后，将PVDF膜置ECL混合液中室温下振荡孵育5 min，X胶片曝光，显影、定影、扫描后，以β-actin表达量为对照观察结果。
　　3 统计学方法
　　采用SPSS11.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4 结果
　　4.1 丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖的影响
　　MTT法检测显示，48 h 时1×l0-8 mol/L E2可使Siha细胞增殖速率明显增加（P<0.01），加入MPP或PHTPP后其促增殖作用均受到抑制。而1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖均具有抑制作用；加入MPP可增强其增殖抑制作用，而加入PHTPP拮抗其增殖抑制作用，见表1。
　　4.2 丹参酮ⅡA对Siha细胞增殖指数的影响
　　48 h时，1×10-8 mol/L E2使Siha细胞增殖指数升高（P<0.01），1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹参酮ⅡA使Siha细胞增殖指数降低（P<0.05，P<0.01），与E2作用趋势相反，主要表现在S期细胞比例降低，而G0/G1期细胞比例增加，见表2、图1。
　　4.3 丹参酮ⅡA对Siha细胞磷酸化细胞外信号调节激酶、细胞周期蛋白D蛋白表达的影响
　　Western blot检测显示，药物作用48 h后，1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA可使Siha细胞p-ERK和Cyclin D表达水平显著降低（P<0.01），且表现出一定的剂量依赖性，见图2。
　　5 讨论
　　据统计，全球范围内宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，在女性恶性肿瘤中居第2位，占所有女性恶性肿瘤患者的13%，且近年来宫颈癌的发病人群呈现出年轻化趋势[7]。据报道，宫颈鳞状上皮癌变是筛查后宫颈活检中最常见的病变[8]，占宫颈癌的95%[9]。本研究针对宫颈癌鳞癌Siha细胞，探讨丹参酮ⅡA对该细胞增殖活性的影响及其可能的分子途径与机制，以期为妇科肿瘤的临床治疗提供依据。 　　本实验结果显示，丹参酮ⅡA具有明显的抑制Siha细胞增殖作用，并使细胞增殖指数显著降低。值得注意的是，在Siha细胞增殖实验体系中加入ERα特异性拮抗剂后，丹参酮ⅡA抑制Siha细胞增殖作用明显增强；而加入ERβ特异性拮抗剂后，丹参酮ⅡA抗Siha细胞增殖作用显著减弱。这一方面说明在Siha细胞中，作用于ER是丹参酮ⅡA发挥增殖抑制作用的重要靶点和途径；另一方面也进一步表明，ERα和ERβ在介导丹参酮ⅡA影响细胞增殖效应中所起的作用不同，丹参酮ⅡA抑制Siha细胞增殖的效应主要机制是经ERβ介导，拮抗ERβ后其抑癌作用明显减弱；而经ERα介导的效应则相反，故加入ERα拮抗剂后其抑癌作用可进一步增强。另有研究显示，ERα与ERβ在介导转录活性方面的作用有所不同，ERβ在抑制基因转录活性方面的作用比ERα更强[10-11]。本研究细胞增殖实验中ERβ被拮抗后丹参酮ⅡA的抑癌作用有所减弱的结果与此一致。
　　影响癌细胞增殖调控通路是抗肿瘤药物发挥作用的主要途径。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是与细胞增生和凋亡调节过程密切相关的关键信号转导途径之一。作为MAPK家族成员，ERK活化后在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化等过程中均可发挥作用。当来自细胞内外的各种丝裂原刺激激活ERK使其磷酸化为p-ERK后，即可活化由该因子介导的增殖相关信号转导通路，并进一步影响细胞增殖、凋亡与侵袭行为[12-13]。万氏等[14]研究表明，ERK/MAPK信号转导通路的异常激活与乳腺癌的浸润性生长有关，表皮生长因子即可通过异常激活ERK/MAPK信号转导通路刺激乳腺癌细胞浸润性生长。Tzu-Ping等[15]也发现，p-ERK随着正常宫颈组织向宫颈癌的进展，表达逐渐增强，表明ERK信号转导通路在正常宫颈组织向宫颈内瘤变的演变过程中起重要作用。齐氏等[16]采用免疫组化SP法观察114例宫颈鳞癌组织和50例正常宫颈组织石蜡标本中p-ERK蛋白表达情况时发现，该蛋白在子宫颈鳞癌中阳性表达率（84.2%）显著高于正常宫颈组织（16.0%）。本实验结果表明，丹参酮ⅡA可降低p-ERK表达，从而抑制p-ERK介导的细胞增殖信号传导通路，下调细胞增殖速率。该结论与章氏等[17]提出的p-ERK在宫颈癌中过量表达的特征是宫颈癌演进过程重要特征的观点相一致。
　　同时，细胞周期中G1期到S期是其中的关键调控点。Cyclin D作为G1期细胞周期素[18]，可促进细胞G1-S期时相的转换[19]，现已被公认为是原癌基因。Cyclin D基因激活并持续高表达，可使G1期缩短，使细胞提前进入S期，从而加速细胞增殖，最终形成肿瘤[20]。宋氏等[21]通过免疫组化SP法观察比较Cyclin D在正常宫颈组织和宫颈鳞状细胞癌（CSCC）中表达情况时发现，Cyclin D高表达与CSCC的发生、发展、侵袭、转移等过程均有密切关系。陈氏[22]也发现在宫颈癌组织中Cyclin D的表达显著高于正常宫颈组织，且其表达与宫颈癌的分化程度及淋巴结转移有关。本研究结果显示，Cyclin D蛋白表达量与对照组比较明显降低，提示丹参酮ⅡA可通过降低周期相关蛋白表达、下调Siha细胞增殖指数发挥抗癌作用。
　　总之，丹参酮ⅡA能明显抑制宫颈癌Siha细胞增殖，其作用机制与经典ER途径有关，并通过抑制p-ERK、Cyclin D表达水平的升高发挥细胞增殖阻滞作用。该结果为全面揭示丹参酮ⅡA通过ER途径发挥抗妇科肿瘤活性的药理机制补充了直接的实验依据，也为妇科肿瘤、特别是宫颈癌鳞癌的临床治疗提供了参考。
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　　（收稿日期：2015-11-01）
　　（修回日期：2015-11-19；编辑：华强）
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