基于液相色谱―串联质谱法分析茉莉酸与果梅休眠的关系

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　　摘要：建立了不同果梅（Prunus mumeSieb.etZuee）品种4个休眠时期花芽的茉莉酸（jasnlonieacid）含量的液相色谱一串联质谱（1iquidchrom atography-tandemtriplequadrupolemassspeetronletrie，LC-MS/MS）测定方法。样品经过甲醇提取，Agela CleanertSPE-NH2固相萃取小柱净化。色谱分离采用c、。反相柱，以乙腈一水（水相含0.05%乙酸）为流动相梯度洗脱，质谱分析采用ESI离子源、二级串联质谱、负离子模式下进行检测。测定结果，方法标准曲线线性良好，茉莉酸r=0.9992，平均回收率范围为78.18%～97.49%，相对标准偏差（RSD，n=3）为1.25%～8.27%。该方法操作简便，灵敏度高，选择性好，回收率高，适合果梅花芽中茉莉酸的测定。结果表明，被测2个品种的果梅花芽中，休眠解除和生态休眠时期的茉莉酸含量高于内休眠和抑制性休眠时期，推测内源激素茉莉酸可能有抑制果梅休眠和促进花芽正常生长的作用。本试验对进一步探讨果梅休眠与内源激素茉莉酸的关系打下了一定的基础。
　　关键词：液相色谱一串联质谱；果梅；休眠；茉莉酸
　　中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0167-04
　　季节性休眠包括抑制性休眠、内休眠和生态休眠3种类型，其中内休眠又称为自然休眠。果树在休眠过程中受到环境因素尤其是光周期和温度的影响启动了一系列的生理生化反应，涉及到植物激素、信号物质和多基因的表达和调控。芽的休眠由内源激素控制，休眠的起始、终止均受激素调节，环境因素（外部信号）也通过影响激素（内部信号）的合成和运输来影响休眠进程而改变低温需求量。通常认为，休眠是由内源激素赤霉素、脱落酸、生长素和乙烯中的促进生长物质和抑制生长物质之间平衡状态决定。近期研究报道植物休眠与生长过程中也相继发现了与茉莉酸代谢相关的基因。
　　茉莉酸类化合物在植物中具有多方面调节功能：（1）信号传导作用。如在植物创伤、胁迫、病虫害过程中，茉莉酸作为一种信号物质在植物体内传递生物或非生物胁迫的信号。（2）生理作用。如调节呼吸作用、花粉的发育、乙烯生物合成、果实的成熟、植物的光合作用和色素的形成、植物根系和植抹的生长，以及植物次生代谢的调节等。（3）基因的调控作用。如茉莉酸生物合成和茉莉酸信号通路相关的AOS、AOC、OPR3、JMT、LOX2，以及JAZs、COH、MYC2等基因都可能受茉莉酸的调控。液质联用技术作为一种新型的现代仪器分析手段，因其高灵敏性、高准确性、高选择性、分析检测范围宽、时间短以及定性定量方面的强大功能等特点，在分析检测领域得到了广泛的应用。本研究通过液质联用方法来测定果梅不同休眠时期花芽内的茉莉酸含量，以期明确果梅休眠与内源激素茉莉酸的关系。
　　1.材料与方法
　　1.1仪器与试剂
　　安捷伦1260液相色谱一（6530系列三级四级杆飞行时间质谱联用仪、Eppendorf/Centrifuge5810R冷冻离心机、真空冷冻干燥机（中国北京博医康实验仪器有限公司生产）、氮吹仪（美国OrganomationAssociates公司生产）、高能量磨样仪等。
　　二氢茉莉酸（dihydrojasmonicacid）购于TCI公司，茉莉酸购于Sigma公司，均为色谱级，产品纯度>98%。甲醇、乙睛：色谱纯，德国Merck公司产品，二氯甲烷（色谱级），乙酸（色谱级），市售纯净水（娃哈哈）。
　　1.2试验材料
　　供试材料为果梅品种桃形梅、丰后，均采自南京农业大学国家果梅种质资源圃。桃形梅为低需冷量的果梅品种，而丰后为高需冷量品种。分别采取不同果梅品种4个休眠时期的花芽，即抑制性休眠（A）、内休眠（B）、生态休眠（c）、休眠解除（D）4个时期。每个品种的花芽分别采于3棵对应品种的树上。采样日期的确定根据不同品种的需冷量和各自物候特征决定。在叶片脱落之前，花芽处于抑制性休眠阶段；等待叶片脱落之后，剪取长势正常的枝条若干用5%蔗糖水放于光照培养箱中，测定萌发率。光照培养箱保持70%的相对湿度，温度为（25±1）℃，光一暗周期16h一8h。蔗糖溶液和新鲜的枝条每3d更换1次，当芽尖端冒出绿色萼片时，即认为萌发了。研究结果，果梅花芽的萌发率与其需冷量呈正相关（r=0.9797）。光照培养箱中枝条的萌芽率小于50%时，此期间采取的花芽被认为处于内休眠阶段；当萌芽率大于50%时，则处于生态休眠阶段。在大田中正常生长的花芽萌发率达到50%时，此阶段采取的花芽则处于休眠解除阶段。
　　1.3样品处理
　　1.3.1茉莉酸提取称取0.1g果梅花芽并加入400ng二氢茉莉酸作为内标物装在2mL离心管中，样品经液氮冷冻磨成细粉末。用800bL80%冷甲醇提取3次，每次涡旋10min，4℃12000r/min离心10min，收集上层液。氮吹浓缩蒸发至水相，用2mol/L的HCI调pH值至2.5～3.0。用等体积乙酸乙酯萃取3次，每次涡旋10min，4℃12000r/min离心10min，吸取上层有机相到同一管中，氮气吹干，待进一步纯化。
　　1.3.2纯化提取步骤中的蒸干样品用1mL二氯甲烷/甲醇（V：V=99：1）溶解淋洗离3次，并将同一重复的2份样品溶解收集到同一管中。纯化用Agela Cleanert SPE―NH2（500mg/6mL）固相萃取小柱。小柱用前用6mL二氯甲烷一甲醇（V：v=99：1）活化。全部6mL样品上柱，弃去过柱废液，用3ml二氯甲烷一甲醇（v：V=99：1）淋洗柱子，弃去淋洗液。用2%的乙酸甲醇溶液分3次洗脱，第1次用4mL，第2、第3次用3mL，用干净的离心管收集洗脱液。洗脱液真空冷冻至干，用0.3mL的0.05%乙酸水溶液一乙睛（V：V=80：20）溶解，再用0.22μm微孔膜过滤，收集滤液-20℃条件下保存备用。待测样品分别标号桃形梅A、桃形梅B、桃形梅c、桃形梅D、丰后A、丰后B、丰后c、丰后D，每个样品设置3份重复。
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