藿香正气制剂中和厚朴酚及总多糖快速测定分析

作者:未知

   摘要:目的  建立HPLC雙波长指纹图谱快速测定藿香正气制剂中和厚朴酚含量的方法,建立糖量计法快速测定其总多糖含量的方法,并分析其差异性。方法  HPLC采用XB-C18(HS)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈和0.1%磷酸水溶液等度洗脱,流速1.0 mL/min,进样量20 μL,检测波长294、270 nm,柱温30 ℃;糖量计法以50%乙醇为阴性对照;聚类分析重复性样品,对比不同指标间的聚类结果。结果  HPLC测得和厚朴酚在1.40~0.14 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好,线性方程为A=12 182 633C-217 418,r?=0.999 5;藿香正气水中和厚朴酚浓度为(0.400 8±0.005 0)mg/mL,藿香正气滴丸中其浓度为(0.487 9±0.008 9)mg/mL。总多糖在0.91~0.29 g/mL范围内与其百分值线性关系良好,线性方程为Y=51.949X+0.868,r2=0.999 9;藿香正气水中总多糖浓度为(0.31±0.003)g/mL,藿香正气滴丸中其浓度为(1.12±0.005)g/mL。聚类分析筛选出和厚朴酚峰面积和总多糖百分值作为表现藿香正气水和藿香正气滴丸间差异的指标。结论  本研究建立的HPLC及糖量计法能有效用于藿香正气制剂多类指标的质量控制及不同剂型间的差异考察;聚类分析筛选出的峰面积和总多糖百分值作为评价指标具有代表性和准确性。
  关键词:藿香正气水;藿香正气滴丸;高效液相色谱法;和厚朴酚;总多糖;快速测定;聚类分析
  中图分类号:R284.1    文献标识码:A    文章编号:1005-5304(2019)05-0078-05
  DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.017 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
  Abstract: Objective To establish a method for rapid determination of honokiol in Huoxiang Zhengqi Preparations by HPLC dual-wavelength fingerprint, and to establish a sugar meter for rapid determination of total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Preparations, and to analyze its differences. Methods HPLC was performed on an XB-C18 (HS) column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous solution for isocratic elution. The flow rate was 1.0 mL/min; the injection volume was 20 μL; the detection wavelength was 294 and 270 nm; the column temperature was 30 ℃. Sugar meter method was performed with 50% ethanol as negative control. Cluster analysis was conducted to analyze repeated samples and comparison of clustering results among different indexes. Results The linear relationship between the concentration of honokiol and the peak area in the range of 1.40–0.14 mg/mL was good by HPLC. The linear equation was A=12 182 633C-217 418, r2=0.999 5. The concentration of honokiol in Huoxiang Zhengqi Liquid was (0.400 8±0.005 0)mg/mL; the concentration of honokiol in Huoxiang Zhengqi Dropping Pills was (0.487 9±0.008 9)mg/mL. The linear relationship between the concentration of total polysaccharide and its percentage was good in the range of 0.91–0.29 g/mL; the linear equation was Y=51.949X+ 0.868, r2=0.999 9. The concentration of total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Liquid was (0.31±0.003)g/mL; the total polysaccharide in Huoxiang Zhengqi Dropping Pills was (1.12±0.005)g/mL. The area of honokiol peak and the percentage of total polysaccharide as indicators of Huoxiang Zhengqi Liquid and Huoxiang Zhengqi Dropping Pills showed significant differences between different formulations. Conclusion Established HPLC and sugar meter method can be effectively used for the quality control and investigation of differences between different dosage forms of Huoxiang Zhengqi Preparations; the selected peak area and total polysaccharide percentage as the evaluation index are representative and accurate.   Keywords: Huoxiang Zhengqi Liquid; Huoxiang Zhengqi Dropping Pills; HPLC; honokiol; total polysaccharide; rapid determination; cluster analysis
  藿香正气处方出自北宋《太平惠民和剂局方》,由苍术、姜制厚朴、陈皮、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、广藿香油、紫苏叶油组成,具有解表化湿、理气和中功效,用于外感风寒、夏伤暑湿或内伤湿滞所致的感冒[1]。该方初以散剂形式用于临床,随着现代中药制剂的发展,为满足便服、便携的需求,已逐渐发展为多种剂型[2-6],尤以藿香正气水和藿香正气滴丸应用广泛[7-8],生产厂家较多,故制剂质量控制尤为重要。目前中药质量控制方法主要包括感官评价、生物评价、化学评价、基因检测等方法,以液相、气相、薄层色谱及质谱等方法建立指纹图谱的化学评价为主,但这只是小分子化合物成分的分析,不能全面反映中药所含成分[9],且对糖类等大分子有效成分研究较少。此外,从“汤者荡也,去大病用之;丸者缓也,舒缓而治之也”,“甘者缓也”等可以看出,中药的疗效与其剂型和工艺密切相关,且与其糖含量有关。因此,本研究以小分子化合物及总糖含量作为评价指标用于质量控制和不同剂型间的差异考察,建立在15 min内同时测定2种藿香正气制剂中和厚朴酚含量及总多糖含量的方法,并多类指标比较分析其差异性,以实现快速、直观、有效的质量控制,达到多类指标控制不同剂型藿香正气制剂的质量,并为不同剂型“荡”与“缓”疗效差异提供依据。
  1  仪器与试药
  Waters1525液相色谱仪(Waters公司),H1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),KQ5200DE型数控超声波震荡仪(上海科学超声仪器有限公司),YD601N型电子天平(上海恒平科技仪器有限公司),YP1002N型电子天平(上海菁海仪器有限公司),WYT-4型手持糖量计(中外合资中友光学仪器有限公司),EKUP-11-20T超纯水机(长沙市科临电子科技有限公司)。
  藿香正气水(湖南汉森制药股份有限公司,批号171103);藿香正气滴丸(天士力制药集团股份有限公司,批号180116);和厚朴酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号0730-9204);蔗糖(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司,批号20080214);乙腈、甲醇为色谱纯(TEDIA);磷酸、无水乙醇为分析纯。
  2  方法与结果
  2.1  仪器条件
  2.1.1  色谱条件
  色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(HS)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈(25∶75),等度洗脱15 min,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL,检测波长294、270 nm。
  2.1.2  糖量计法测定条件
  在标准温度20 ℃条件下,以纯化水为空白调整折光率至0%,取蔗糖对照品和供试品溶液,以50%乙醇为阴性对照,点样进行测定。
  2.2  对照品溶液的制备
  2.2.1  和厚朴酚对照品溶液
  精密称取和厚朴酚对照品14.0 mg,加甲醇溶解定容至5 mL,即得2.8 mg/mL的和厚朴酚贮备液。精密量取和厚朴酚贮备液1 mL,加甲醇定容至10 mL,超声脱气,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得0.28 mg/mL的和厚朴酚对照品溶液。
  2.2.2  蔗糖对照品溶液
  精密称取蔗糖20.0 g,加纯化水20 mL,溶解,即得1.0 g/mL的蔗糖贮备液。精密量取蔗糖贮备液1 mL,加纯化水1 mL,摇匀,即得0.5 g/mL的蔗糖对照品溶液。
  2.3  供试品溶液的制备
  2.3.1  色谱法供试品溶液
  取藿香正气水10 mL,12 000 r/min离心10 min,取上层溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,超声,即得藿香正气水HPLC供试品溶液。
  取藿香正气滴丸2.6 g,碾碎,精密加入50%乙醇10 mL,密塞,超声(功率300 W,频率40 kHz)40 min,静置过夜,12 000 r/min离心10 min,取上层溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,超声,即得藿香正气滴丸HPLC供试品溶液。
  2.3.2  糖量计法供试品溶液
  取藿香正气水10 mL,超声10 min使沉淀物溶解,摇匀,即得藿香正气水糖量计法供试品溶液。
  取藿香正气滴丸2.6 g,碾碎,精密加入50%乙醇10 mL,密塞,超声40 min,静置过夜,移取上层溶液,即为藿香正气滴丸糖量计法供试品溶液。
  2.4  空白溶剂考察
  2.4.1  色谱法
  取50%乙醇,按“2.1.1”項下色谱条件进样分析,结果表明溶剂对和厚朴酚含量测定无干扰。
  2.4.2  糖量计法
  取50%乙醇,按“2.1.2”项下糖量计法测定条件点样分析,结果表明溶剂无干扰。
  2.5  线性关系考察
  2.5.1  色谱法
  精密量取25 μL和厚朴酚贮备液6份,分别精密加入甲醇25、75、100、142、225、420 μL,摇匀,即得1.40、0.70、0.56、0.42、0.28、0.14 mg/mL的和厚朴酚对照品溶液,并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定,以色谱峰面积(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线。测得和厚朴酚浓度在1.40~0.14 mg/mL范围内的线性方程为A=12 182 633C-217 418,r?=0.999 5。   2.5.2  糖量计法
  精密量取1 mL蔗糖贮备液6份,分别精密加入纯化水100、500、1000、1500、2000、2500 μL,摇匀,即得0.91、0.67、0.50、0.40、0.33、0.29 g/mL的蔗糖对照品溶液,并按“2.1.2”项下糖量计法条件进行测定,以百分值为纵坐标,质量浓度为横坐标,绘制标准曲线。测得蔗糖浓度在0.91~0.29 g/mL范围内的线性方程为Y=51.949X+0.868,r?=0.999 9。
  2.6  精密度试验
  2.6.1  色谱法
  取“2.2.1”项下和厚朴酚对照品,按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次,进样量20 μL,和厚朴酚峰面积RSD=1.09%,表明HPLC仪器精密度良好。
  2.6.2  糖量计法
  取“2.2.2”项下0.5 g/mL的蔗糖对照品溶液,按“2.1.2”项下糖量计法测定条件重复点样6次,每次3滴,结果蔗糖百分值RSD=0.38%,表明糖量计法精密度良好。
  2.7  重复性试验
  2.7.1  色谱法
  取藿香正气水和藿香正气滴丸的同一批样品各6份,按“2.3.1”项下方法制备HPLC供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样分析,藿香正气水中和厚朴酚峰面积RSD=1.16%,藿香正气滴丸中和厚朴酚峰面积RSD=0.85%,表明HPLC方法重复性均良好。
  2.7.2  糖量计法
  取藿香正气水和藿香正气滴丸的同一批样品各6份,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,以纯化水为空白,按“2.1.2”项下糖量计法测定条件点样分析,藿香正气水中总多糖RSD=0.53%,藿香正气滴丸中总多糖RSD=0.35%,表明糖量计法重复性均良好。
  2.8  稳定性试验
  2.8.1  色谱法
  取“2.3.1”项下藿香正气水和藿香正气滴丸HPLC供试品溶液,分别在0、4、8、16、24、48 h进样分析,进样量20 μL,结果和厚朴酚峰面积RSD分别为1.19%、1.68%,表明HPLC供试品溶液在48 h内稳定性均良好。
  2.8.2  糖量计法
  取“2.3.2”项下藿香正气水和藿香正气滴丸糖量计法供试品溶液,分别在0、4、8、16、24、48 h点样分析,结果总多糖RSD分别为1.55%、1.15%,表明糖量计法供试品溶液在48 h内稳定性均良好。
  2.9  加样回收率试验
  2.9.1  色谱法
  取“2.3.1”项下藿香正气水和藿香正气滴丸HPLC供试品溶液0.5 mL,分别加入“2.2.1”项下和厚朴酚对照品溶液0.5 mL,摇匀,即得加样回收供试品溶液,各平行配制6份,按“2.1.1”项下色譜条件测定,分别计算回收率。结果藿香正气水和藿香正气滴丸中和厚朴酚平均回收率分别为100.07%、100.00%,RSD分别为1.04%、0.87%,见表1。表明该方法准确性良好。
  2.9.2  糖量计法
  取“2.3.2”项下藿香正气水和藿香正气滴丸总多糖糖量计法供试品溶液0.5 mL,分别加入“2.2.2”项下蔗糖溶液0.5 mL,摇匀,即得加样回收供试品溶液,各平行配制6份,按“2.1.2”项下糖量计法条件测定,分别计算回收率。藿香正气水和藿香正气滴丸中总多糖平均回收率分别为98.50%、98.02%,RSD分别为1.79%、0.48%,见表2。表明该方法准确性良好。
  2.10  样品含量测定
  2.10.1  色谱法
  按“2.3.1”项下方法制备藿香正气水和藿香正气滴丸HPLC供试品溶液,并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定,色谱图见图1。采用回归方程法和外标法,以藿香正气滴丸与藿香正气水每剂等量计算和厚朴酚含量,结果见表3。2种方法计算所得差异较小,均适用于和厚朴酚含量计算,本研究以2种方法计算结果的平均值作为和厚朴酚含量值。
  2.10.2  糖量计法
  按“2.3.2”项下方法制备藿香正气水和藿香正气滴丸糖量计法供试品溶液,并按“2.1.2”项下糖量计法条件进行测定,用回归方程法计算,以藿香正气滴丸与藿香正气水每剂等量计,结果见表4。2种制剂的总多糖含量RSD=78.08%,浓度RSD=79.91%。
  2.11  聚类分析
  指标及变量越多,对数据整体分析的难度就越大,因此,通常在处理多变量、多指标数据时,需要对指标进行筛选。本研究考察了不同指标(和厚朴酚峰面积、百分峰面积及总多糖百分含量)对6次重复性的藿香正气水和藿香正气滴丸分类的影响,聚类分析结果见图2~图5。
  可见,和厚朴酚峰面积、百分峰面积及总多糖百分值三者同时作为参数时可对藿香正气水和藿香正气滴丸进行准确分类,和厚朴酚峰面积和总多糖百分值可分别对藿香正气水和藿香正气滴丸进行准确分类,而百分峰面积将藿香正气水和藿香正气滴丸乱序分类。因此,以和厚朴酚峰面积及总多糖百分值作为藿香正气水和藿香正气滴丸分类指标,较百分峰面积更能体现不同制剂间的差异,既不会丢失有用的指标信息,又能减少某类指标带来的误差,降低整体分析的难度。
  3  讨论
  本试验采用HPLC在15 min内快速、同时测定藿香正气制剂中和厚朴酚含量,以糖量计法快速测定其总多糖含量,并对多类指标比较分析其差异性,分别进行了方法学研究。HPLC通过和厚朴酚回归方程法和外标法计算得出藿香正气水和藿香正气滴丸的和厚朴酚含量,采用糖量计法测定了藿香正气水和藿香正气滴丸中总多糖含量,以小分子化合物及总糖含量同时作为评价指标用于质量控制和不同剂型间的差异考察,具有系统性、特征性、稳定性的特点,能实现快速、直观、有效的质量控制,达到多类指标控制不同剂型藿香正气制剂的质量,并为不同剂型间“荡”与“缓”的疗效差异提供依据。   本研究通过对比考察不同指标(和厚朴酚峰面积、百分峰面积及总多糖百分值)的聚类分析结果,筛选出和厚朴酚峰面积和总多糖百分值作为藿香正气水和藿香正气滴丸的指标来体现不同制剂间的差异,降低了数据整体分析的难度。
  本试验通过对2种藿香正气制剂中和厚朴酚含量及总多糖含量进行比较,分析得到藿香正气水的和厚朴酚浓度为(0.400 8±0.005 0)mg/mL,总多糖含量为(17.0±0.15)%,相当于(0.31±0.003)g/mL;等剂量藿香正气滴丸中的和厚朴酚浓度为(0.487 9±0.008 9)mg/mL,总多糖含量为(59.0±0.28)%,相当于(1.120±0.005)g/mL。2种藿香正气制剂的和厚朴酚含量及总多糖含量均有明显差异,等剂量藿香正气滴丸中和厚朴酚含量较藿香正气水略高,而总多糖含量明显高于藿香正气水。通过小分子化合物和总多糖含量分析,能达到多类指标同时控制不同剂型藿香正气制剂的质量,也可以为同药不同剂型间的疗效差异提供依据。
  参考文献:
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  (收稿日期:2018-09-17)
  (修回日期:2018-10-09;编辑:陈静)
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