天津市售主要经济贝类中麻痹性贝类毒素污染现状及特征分析

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　　摘要：使用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）检测9种天津市售主要经济贝类中13种麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）的含量，分析PSP的污染现状和成分特征。结果显示，共计6个品种（紫贻贝、虾夷扇贝、牡蛎、毛蚶、脉红螺、菲律宾蛤仔）检出PSP。其中虾夷扇贝、紫贻贝、毛蚶3个品种的检出率较高且含量较高，检出率分别为66.7%、58.3%、58.3%。PSP中检出率较高的毒素包括N-磺酰胺甲酰基类毒素C1、C2和膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3，毒力占比主要以膝沟藻毒素GTX1-4为主，毛蚶蓄积STX毒素的能力强于其他贝类。全年的PSP含量季节变化为夏季最高，冬季最低。PSP主要存在于贝类的消化腺内，全年不同月份的PSP含量均在安全食用范围内。
　　关键词：麻痹性贝类毒素;LC-MS/MS;污染现状;特征分析
　　贝类由于高度的环境依赖性、食物滤食性等生理特性决定了其质量安全状况极易受外界环境的影响，是水产品中风险较高的品种。近年来，因食用贝类导致中毒的事件屡有发生，天津作为贝类消费量较大的城市，风险隐患较高。目前市面上的贝类中毒事件大部分都是由贝类毒素导致的。贝类毒素有多种类型，其中分布范围最大，发生频率最高，人体危害最大的是麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）[1-2]，因此对PSP的污染状况和成分特征进行分析显得尤为重要。
　　小鼠生物法和液相色谱法是目前PSP主要检测方法，两种方法被许多国家采用，但也存在着很多缺陷，如小鼠生物法灵敏度比较差[3]，无法确定毒素的组成和具体含量，液相色谱法操作比较繁琐、干扰较大[4]。使用液相色谱与串联质谱法（LC-MS/MS）检测可以确定PSP各毒素的组成并精确定量，可为进一步开展PSP的研究提供有效的技术手段。
　　本文使用LC-MS/MS检测了天津市售主要经济贝类中13种PSP，分析PSP的成分特征和分布现状，为监管部门开展针对性的监控预警工作提供基础数据支撑。
　　1材料和方法
　　1.1样品采集
　　2017年9月至2019年7月，为期两年采集天津市沿海码头捕获、批发市场销售的主要经济贝类。每两个月采样1次，共12次采集了缢蛏、紫贻贝、四角蛤蜊、虾夷扇贝、牡蛎、毛蚶、脉红螺、菲律宾蛤仔、扁玉螺9个品种的156个贝类样品。具体样品名称及数量，见表1。每个样品采集3 kg，采样后送至制样室处理，用清水清洗贝类，开壳取出全部贝类组织，经高速组织搅碎机搅碎后均分为两份，将样品置于-18 ℃保存。
　　1.2试剂
　　乙腈（C2H3N）：色谱纯;甲酸（CH2O2）：色谱纯;乙酸（C2H4O2）：色谱纯;甲酸铵（CH5NO2）：优级纯;氨水（H5NO）：优级纯。13种麻痹性贝类毒素（PSP）标准物质：石房蛤毒素STX，新石房蛤毒素NEO，膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4，N-磺酰胺甲酰基类毒素GTX5、C1、C2，脱甲酰基类毒素dcSTX、dcGTX2、dcGTX3、dcNEO，均购置于加拿大海洋生物研究所（NRC）。
　　1.3仪器设备
　　AB SCIEX 4000QTRAP三重四级杆质谱仪;岛津LC-20A高效液相色谱仪;Milli-Q Advantage A10超纯水系统;固相萃取装置;固相萃取小柱Supelco ENVI-Carb;电子天平;均质机;漩涡震荡器;高速冷冻离心机;恒温水浴锅;孔径0.22 μm滤膜;2 mL注射器。
　　1.4前处理方法
　　前处理改进自吴海燕等[5]，准确称取5.0 g贝类组织，置于50 mL塑料离心管内，加入5 mL 1%乙酸溶液提取，旋紧盖子后漩涡混匀2 min，超声提取10 min。将离心管放入沸水中煮沸5 min后取出，使用流水冲洗管壁使其至室温。将离心管4 ℃ 10 000 r/min冷冻离心5 min，吸取1.5 mL上清液加入2 mL离心管内，加入5 μL 氨水漩涡混匀等待过柱。
　　依次用3 mL乙腈、3 mL 20%乙腈水溶液（含1%乙酸）、3 mL 0.1%氨水淋洗Supelco ENVI-Carb小柱进行活化。准确量取1 mL提取液导入固相萃取柱，自然流速过柱，待样品流尽后加入1 mL纯水进行淋洗。纯水流尽加入1 mL 75%乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液过0.22 μm滤膜，移至进样瓶中上机分析。
　　2结果与分析
　　2.1毒力转换与结果
　　以STX毒素为标准，将STX的毒性因子设为1，其它12种毒素根据其相对于STX的毒性大小确定各自的毒性因子[6]，13种毒素的毒性因子见表2。13種PSP的检测结果统一转换为STX的毒力当量（STXeq），来表示样品PSP的总毒力（单位： μg STXeq/kg）。根据下列公式计算：
　　STXeq=∑ni=1Xi·ri
　　式中：Xi—各种PSP含量;
　　ri—毒性因子;
　　所检测贝类样品的PSP总毒力平均结果见表3。
　　2.2PSP的种间差异
　　检测的156个样品中，44个样品检出PSP，检出率为28.2%。按品种数统计，共计6个品种检出PSP，占全部品种数的66.7%。其中虾夷扇贝、紫贻贝、毛蚶的检出率较高且含量较高，3个品种检出率分别为66.7%、58.3%、58.3%。从平均检出浓度范围来看，虾夷扇贝为19.3～1634 μg/kg、紫贻贝为15.3～288.5 μg/kg、毛蚶为37.6～149.0 μg/kg，牡蛎、脉红螺、菲律宾蛤仔检出率分别为16.6%、20.8%、16.6%，检出浓度范围4.9～54.3 μg/kg，浓度较低，其它品种未检出。 　　2.3PSP的成分组成特征
　　13种PSP中有10种检出，各毒素的检出率如下：STX为9.6%、GTX1为16.7%、GTX2为19.9%、GTX3为17.9%、GTX4为9.6%、GTX5为9.0%、C1为20.5%、C2为19.2%、dcGTX2为12.2%、dcNEO为3.2%。膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3和N-磺酰胺甲酰基类毒素C1、C2的检出率较高，说明PSP主要由于中、低毒力的毒素组成，高毒力毒素仅GTX1检出率比较高。毛蚶体内的STX的检出率高于其他品种，说明毛蚶蓄积高毒力毒素STX的能力较强。
　　分别从虾夷扇贝、紫贻贝、毛蚶三种样品中选取8、7、11个检出种类较多且含量较高批次，分析其毒素成分特征，结果显示：
　　8个批次阳性虾夷扇贝样品中PSP毒力以膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX 3、GTX4为主（均检出，平均占比87.1%）。4批次检出石房蛤毒素STX（占比10.9%～38.1%），4批次样品检出脱甲酰基类毒素dcNEO（占比14.4%～35.4%），还有少量的C1、C2（<5%）。
　　7个批次的阳性紫贻贝样品中PSP毒力以膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4为主（均检出，平均占比81.5%）。有3批次样品中含有STX（占比10.8%～32.5%），2批次样品中检出dcNEO（3.9%和10.4%），还有少量的C1、C2（<5%）。
　　11个批次阳性毛蚶的样品PSP毒力以膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX 3、GTX4（均检出，平均占比64.4%）与石房蛤毒素STX（8个批次检出，平均占比30.9%）为主。5个批次检出dcNEO（平均占比12.6%）;5个批次检出dcGTX2（平均占比6.7%），还有10批次检出少量的C1、C2（<5%）。
　　从毒力组成看，主要为膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4，其次是石房蛤毒素STX和脱甲酰基类毒素dcGTX2、dcNEO，N-磺酰胺甲酰基类毒素C1、C2的检出率较高但其毒力较低。
　　2.4PSP的季节变化特征
　　从虾夷扇贝、紫贻贝、毛蚶这3个品种中PSP毒力结果的季节变化可以看出 （图1所示），夏季（7月）的PSP毒力最强，冬季的毒力最低。从季节变化来看为夏季>秋季>春季>冬季，此结果与部分人的研究并不完全一致[7-8]。可能由于PSP為贝类从产毒藻类中获得的外源性毒素，不同海域环境温度等差别较大。本文所检测的贝类产地均为渤海海域，黄世玉等[9]研究了温度对产毒藻的生长影响，发现其最适宜温度为22 ℃。而渤海海域近岸7月表层水温为18.4～26.6 ℃[10]，为产毒藻适宜生长温度，与本文结果相符。并且PSP受赤潮等突发事件影响较大，并不一定遵循规律性。
　　2.5PSP在贝类体内的分布特征
　　为了解贝类中不同部位的毒素含量，将检PSP的紫贻贝、虾夷扇贝、毛蚶样品去壳后，将部分样品中的消化腺分离出来，分别测定消化腺和其它贝肉中PSP含量。结果显示，紫贻贝、虾夷扇贝、毛蚶消化腺中的PSP含量较高，其它贝肉组织中PSP含量较低或未检出，贝类体内的PSP主要分布于消化腺内。
　　2.6样品的超标情况
　　目前，绝大多数国家与欧盟将80 μg STXeq/100 g定为PSP的限量标准，方法为小鼠生物法和高效液相色谱法[11]。我国的《贝类生产环境卫生监督管理暂行规定》中规定麻痹性贝类毒素（PSP）总含量低于800 μg/kg。因此本文将800 μg STXeq/kg作为安全限量标准。
　　从本次检测的最高检出浓度来看，虾夷扇贝为220.8 μg/kg、紫贻贝为288.5 μg/kg、毛蚶为180.9 μg/kg。对比800 μg STXeq/kg的标准，9种贝类全年的麻痹性贝毒含量均在安全食用范围内，可安全食用，不会对健康产生影响。但对最高检出浓度的紫贻贝样品消化腺进行单独检测，结果显示PSP检测值为728.3 μg/kg，远高于全贝组织的检测值，接近 800 μg/kg的安全食用标准。为了安全起见，食用贝类时可先去除消化腺，能够有效地防止PSP中毒风险。
　　3总结
　　所检测的9种主要经济贝类PSP毒力当量均低于安全限量，天津市售主要经济贝类均可安全食用。从季节变化来看，夏秋季贝类体内PSP含量较高，应加强注意。PSP主要存在于贝类的消化腺内，为安全起见可去除消化腺后再食用贝类。13种PSP毒素除GTX1外主要检出毒素为中、低毒力毒素，毛蚶对STX毒素的蓄积能力高于其它贝类。
　　目前天津市售主要经济贝类主要产地均为渤海海域，渤海海域富营养化程度整体较高，赤潮现象时有发生，因此PSP超标风险依然存在。有关部门应加强PSP监测，提高监测频率和覆盖范围，监测贝类产品的同时监测产毒藻类。建立完整的风险预警体系及管理控制措施，监测到有贝类产品超标、养殖海域发生赤潮等突发灾害时，应及时通知生产者和消费者，更好地保证贝类的生产安全和消费者的生命安全。
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　　Analysis of pollution status and composition characteristics of PSP
　　in main economic shellfish sold in Tianjin
　　SHI Wenbo，GAO Lina，HAN Xianqin，LI Chunqing，CHEN Yongping
　　（Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring and Agricultural Product Quality Testing Center，Tianjin  300221）
　　Abstract：Determination of 13 paralytic shellfish poisonings （PSP） in 9 commercial shellfish in Tianjin by LC-MS / MS，analyze the pollution status and composition characteristics of PSP.The results showed that PSP was detected in 6 species of shellfish.The detection rate of Mytilus edulis，Patinopecten yessoensis and Scapharca subcrenata was higher，which were 66.7%，58.3% and 58.3% respectively.The detection rates of N-sulfonamide formyl toxins C1，C2 and gonyan toxin GTX1，GTX2，GTX3 were high，gonyautoxin GTX1-4 were the main toxin in the virulence ratio.The content of STX in Scapharca subcrenata was significantly higher than that in other species.The seasonal variation of toxin content was the highest in summer and the lowest in winter.PSP mainly exists in the digestive gland of shellfish.The content of PSP in the whole year was within the safe range.
　　Key words：PSP; LC-MS/MS; pollution status; feature analysis
　　（收稿日期：2019-11-29）
　　基金項目：天津市水产局科研推广项目J2017-08，天津主要经济贝类中贝类毒素现状调查与分析。
　　作者简介：时文博（1986.5-）男，工程师，研究方向：水产品质量安全。E-mail：shiwb512@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.02.010
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