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响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺及其抗氧化作用

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  摘要:考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等单因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响,采用响应面Box-Behnken Design优化辽东楤木总皂苷的提取工艺,并对辽东楤木总皂苷进行提取量测定及抗氧化作用的研究。响应面法最终优化结果表明,乙醇体积分数为85%,液料比为20 mL ∶ 1 g,超声时间为60 min,在此条件下测得辽东楤木中总皂苷类提取量为94.93 mg/g,与预测值良好吻合。抗氧化活性结果表明,辽东楤木总皂苷类对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,简称DPPH)自由基和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),简称ABTS]自由基均有较好的清除能力,当总皂苷的质量浓度为 57.83 mg/mL 时,对DPPH自由基的清除率最大,为92.17%;而对ABTS自由基的清除能力在总皂苷质量浓度为19.28~96.39 mg/mL 范围内逐渐增强,当其质量浓度为96.39 mg/mL时,对ABTS自由基的清除率为100%。
   关键词:辽东楤木;响应面法;总皂苷;提取工艺;DPPH自由基;ABTS自由基;清除率;抗氧化作用
   中图分类号: R284.2  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2020)03-0204-05
   辽东楤木[Aralia elata(Miq.)Seem.]别称龙牙楤木、刺龙牙、刺嫩芽、刺老鸦、东北野香椿等,是一种食药兼用型的五加科(Araliaceae)楤木属(Aralia)植物,为多年生落叶灌木或小乔木[1]。在亚洲地区分布广泛,我国主要分布在辽宁、吉林、黑龙江等地的山区,尤其在长白山地区以及小兴安岭一带分布最为广泛;在日本、朝鲜和俄罗斯的西伯利亚地区分布也相对较多[1-2]。传统中医药记载其主要药用部位为树皮和根皮,具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效,可用于风湿性关节炎、肾气不足等症的辅助治疗[3-4]。现代研究表明,辽东楤木中主要含有皂苷类、氨基酸类、油脂类、黄酮类以及一些微量元素等化学成分,其中现代文献对总皂苷类成分的研究最为广泛,目前已经分离出了皂苷的多种苷元[5-8]。此外,对于辽东楤木药理作用的研究也较丰富,辽东楤木可以刺激肾上腺皮质系统而具有一定的抗炎作用,尤其对缓激肽介质的合成与释放有明显的抑制作用,临床上还用于治疗肾虚阳痿、气虚无力等症[4,9-10]。通过对辽东楤木总皂苷提取工艺的优化以及抗氧化作用的研究,为辽东楤木保健产品的开发研究提供科学依据。
  1 材料与方法
  1.1 材料、仪器与试剂
  辽东楤木嫩芽样品采于辽宁省丹东市,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为五加科(Araliaceae)楤木属(Aralia Linn.)辽东楤木[Aralia elata (Miq.) Seem]的芽,低温烘干,粉碎并过60目筛备用。
  主要仪器有UV-1500型紫外-可见分光光度计,购自翱艺仪器(上海)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,购自常州赛普实验仪器厂;AR2140电子分析天平,购自奥豪斯仪器(上海)有限公司;KQ5200DB型数控超声波清洗器,购自昆山超声仪器有限公司;101型电热鼓风干燥箱,购自北京市永光明医疗仪器有限公司;HP-01无油真空泵,购自邦西仪器科技(上海)有限公司。
  主要试剂有齐敦果酸对照品(批号为110709-200304)、DPPH试剂(批号为6KCYN-LT)、ABTS試剂(批号为619H032)、L(+)-抗坏血酸,均购于中国药品生物制品检定所,对照品纯度达到98%以上;高氯酸、香草醛、冰乙酸、二氯甲烷、乙醇均为分析纯,水为蒸馏水。
  1.2 试验方法
  1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取齐敦果酸对照品适量,加入甲醇制成含有1.002 mg/mL齐敦果酸对照品溶液[11]。
  1.2.2 标准曲线的制备 精确吸取齐敦果酸对照品溶液40、60、80、100、120 μL,置于5 mL的容量瓶中,挥干溶剂,加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液,0.8 mL高氯酸,于60 ℃水浴中加热20 min,放冷后用冰乙酸稀释至刻度[12]。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度(y)测定,以测得的吸光度(y)为纵坐标、对照品的质量(x)为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程为y=8.384 5x-0.010 22,r=0.999 9,线性范围为0.04~0.12 mg。测定结果见表1。
  1.2.3 单因素对总皂苷提取量的影响试验 通过单一变量分别考察乙醇体积分数、液料比、超声时间等因素对辽东楤木总皂苷提取量的影响,以获得单因素影响提取工艺的最佳范围[13]。
  1.2.3.1 乙醇体积分数对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份,每份1.0 g,精确称定,分别置于具塞锥形瓶中,精确加入70%、75%、80%、85%、90%乙醇30 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率 100 W)60 min,放冷,再称定质量,用相应体积分数的乙醇补足失质量,摇匀,滤过,分别取续滤液20 μL,置于5 mL量瓶中,挥干溶剂,加入5 mL 0.4%香草 醛- 冰乙酸溶液,0.8 mL高氯酸,于 60 ℃ 水浴中加热20 min,放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定,并测定不同乙醇浓度下的总皂苷提取量。
  1.2.3.2 超声提取时间对总皂苷含量的影响 称取辽东楤木粉末5份,每份1.0 g,精确称定,分别置具塞锥形瓶中,精确加入85%的乙醇30 mL,密塞,称定质量,分别选取35、50、65、80、95 min等5个时间点进行超声处理(功率100 W),放冷,再称定质量,用85%乙醇补足失质量,摇匀,滤过,分别取续滤液20 μL,置于5 mL量瓶中,挥干溶剂,加入 0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液,0.8 mL高氯酸,于60 ℃水浴中加热20 min,放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光值测定,并测定不同超声时间的总皂苷提取量。   1.2.3.3 液料比对总皂苷提取量的影响 称取辽东楤木粉末5份,每份1.0 g,精确称定,分别置于具塞锥形瓶中,精确加入85%乙醇各15、20、25、30、35 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率100 W)60 min,放冷,再称定质量,用85%乙醇补足失质量,摇匀,滤过,分别取续滤液20 μL,置于5 mL量瓶中,挥干溶剂,加入0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液,0.8 mL高氯酸,于60 ℃水浴中加热20 min,放冷后用冰乙酸稀释至刻度。采用紫外分光光度法于548 nm下进行吸光度测定,并测定不同液料比的总皂苷提取量。
  1.2.4 响应面法优化提取总皂苷类工艺的试验设计 根据单因素的试验结果,选取超声时间、液料比、乙醇体积分数等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素,进行3因素3水平的响应面设计,设计的因素及水平见表2。
  1.2.5 辽东楤木总皂苷的抗氧化试验
  1.2.5.1 辽东楤木总皂苷对1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,简称DPPH自由基)清除能力的测定
  1.2.5.1.1 DPPH工作液的制备 精确称取DPPH固体适量,置于250 mL量瓶中,用无水乙醇进行定容,摇匀,制成质量浓度为10 mg/mL的DPPH工作液。
  1.2.5.1.2 辽东楤木总皂苷清除DPPH自由基的测定方法 分别精确吸取DPPH工作液4 mL和不同质量浓度的总皂苷溶液2 mL置于试管中,混合均匀后在室温下避光处理60 min,然后在波长为 517 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;再分别精确吸取 4 mL 无水乙醇和不同质量浓度的2 mL总皂苷溶液,按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL DPPH工作液和2 mL无水乙醇作为空白对照,按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的测定,以L(+)-抗坏血酸作为阳性对照。DPPH自由基清除率=[D0-(D1-D2)]/D0×100%[14-16]。
  1.2.5.2 辽东楤木总皂苷对ABTS自由基清除能力的测定
  1.2.5.2.1 ABTS工作液的制备 称量386 mg的ABTS用蒸馏水溶解后,定容至100 mL;再称取 376.8 mg 的过硫酸钾用蒸馏水溶解后,定容至 25 mL;取100 mL ABTS溶液和4.6 mL过硫酸钾溶液混合,使ABTS溶液的浓度为7 mmol/L,过硫酸钾溶液的浓度为2.45 mmol/L,以上2种溶液混合后于室温下避光处理16 h,使用前用无水乙醇进行进行稀释,使其在波长为734 nm处的吸光度值在0.7左右[17]。若在ABTS工作液中加入辽东楤木的总皂苷溶液后,吸光度下降,说明该溶液对ABTS自由基存在清除作用,否则反之。
  1.2.5.2.2 辽东楤木醇提物清除ABTS自由基的测定方法 精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液,并将其置于试管中混合均匀,在室温下避光处理60 min,然后在波长为 734 nm 的条件下进行吸光度D1的测定;分别精确吸取4 mL无水乙醇和0.6 mL不同质量浓度的总皂苷溶液,按照上述方法同等处理后进行吸光度D2的测定;分别精确吸取4 mL ABTS工作液和0.6 mL无水乙醇作为空白对照,按照上述方法同等处理后进行吸光度D0的測定,以L(+)-抗坏血酸作为阳性对照。ABTS自由基清除率=[D0(D1-D2)]/D0×100%[18]。
  2 结果与分析
  2.1 单因素试验结果与分析
  2.1.1 不同体积分数乙醇对总皂苷提取量的影响 在超声提取时间为60 min、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下,不同乙醇浓度对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图1。辽东楤木总皂苷提取量随着乙醇体积分数的增加先升高再降低,当乙醇体积分数升至85%时,辽东楤木总皂苷提取量达到最大;当乙醇体积分数大于85%时,总皂苷提取量急剧降低。根据提取化学成分相似相容的原理,结合辽东楤木总皂苷含有的化学成分类型,将乙醇体积分数控制在75%~85%。
  2.1.2 超声提取时间对总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、液料比为30 mL ∶ 1 g的条件下,不同超声提取对辽东楤木总皂苷提取的影响见图2。超声提取时间在35~65 min范围内,辽东楤木总皂苷提取量呈升高趋势,在65 min时达到最大值,再增加提取时间,总皂苷提取量降低。随着提取时间的延长,总皂苷不断被提取出来,65 min后总皂苷提取量降低,一方面可能是总皂苷发生水解、结构发生变化,另一方面提取出来的其他成分影响总皂苷的提取量,因此提取时间应控制在50~80 min。
  2.1.3 液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响 在乙醇体积分数为85%、超声提取时间为65 min的条件下,不同液料比对辽东楤木总皂苷提取量的影响见图3。液料比从15 mL ∶ 1 g增大到20 mL ∶ 1 g时,由于浓度差异扩大导致辽东楤木总皂苷向溶液迅速渗透,使其提取量显著增加;在(25~35) mL ∶ 1 g液料比的范围内,对辽东楤木总皂苷的提取量影响不大,液料比应控制在(15~25) mL ∶ 1 g。
  2.2 响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺试验结果
  2.2.1 响应面设计方案与结果 在单因素试验考
  察的基础上,依据Box-Behnken中心设计原理,确定响应面分析的因素和水平,选择超声时间(x1)、液料比(x2)、乙醇体积分数(x3)等3个因素为影响总皂苷提取量的主要因素,辽东楤木总皂苷提取量为响应值进行考察。运用Design-Expert 8.0.5软件进行响应面设计和分析,对辽东楤木总皂苷提取工艺进行优化,试验结果见表3。    运用Design-Expert 8.0.5软件,得出辽东楤木总皂苷提取量与超声时间(x1)、液料比(x2)、乙醇体积分数(x3)之间的回归方程:y=5 662.82+15.49x1-14.79x2-148.44x3-0.099x1x2+0.027x1x3-0.23x2x3-0.12x21+0.80x22+0.95x23(r2=0.997 9,r2a=0.995 2)。回归分析及方差分析结果见表4。
   回归方程的P<0.01,说明本试验采用的回归模型具有统计学意义;失拟项的P值为0.974 8>0.05,说明回归模型无失拟因素的存在,拟合程度相对较好,可反映出总皂苷的提取量与液料比、超声时间、乙醇浓度之间的关系,说明响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺的可行性。通过对试验结果的拟合分析,得出最佳的提取工艺:液料比为 20 mL ∶ 1 g,超声时间为58.97 min,乙醇体积分数为84.95%,总皂苷提取量的预测值为 95.34 mg/g。根据影响因素的实际情况,可将提取工艺调整为液料比20 mL ∶ 1 g,超声时间60 min,乙醇体积分数85%。在此条件下对辽东楤木药材进行提取工艺的验证,测得平均总皂苷提取量为 94.93 mg/g,实测值与预测值的偏差为0.43%,体现回归方程具有较好的可行性。
  2.2.2 辽东楤木总皂苷提取工艺的验证 称取 1.0 g 辽东楤木粉末,精确称定,置于具塞锥形瓶中,精确加入20 mL 85%乙醇,密塞,称定质量,超声处理(功率100 W)60 min,放冷,再称定质量,用85%乙醇补足失质量,摇匀,滤过,取续滤液20 μL,按照标准曲线的制备方法进行测定。根据上述方法测得辽东楤木总皂苷的提取量为94.93 mg/g,且方法学考察的各项指标均符合要求,测定结果见表5。
  2.3 辽东楤木总皂苷的抗氧化活性
  2.3.1 辽东楤木总皂苷对DPPH自由基的清除能力 辽东楤木总皂苷对DPPH自由基有一定的清除作用,表现出较强的抗氧化能力,但与对照药物抗坏血酸相比,辽东楤木总皂苷的抗氧化能力要弱于抗坏血酸。总皂苷溶液的质量浓度在0.1~0.4 mg/mL范围内时,总皂苷质量浓度的变化对DPPH自由基清除率的影响较大,当总皂苷质量浓度为0.4 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为 87.30%;而总皂苷质量浓度在大于0.4 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率变化平缓,清除能力达到最高极限,测定结果见图4。
  2.3.2 辽东楤木总皂苷对ABTS自由基的清除能力 辽东楤木总皂苷清除ABTS自由基的能力随总皂苷溶液质量浓度的增加而增强;不同质量浓度抗坏血酸清除ABTS自由基的能力恒定,但辽东楤木总皂苷溶液清除ABTS自由基的能力弱于抗坏血酸。总皂苷溶液的质量浓度在0.1~0.6 mg/mL范围内,对ABTS自由基的清除能力与质量浓度呈正相关;当质量浓度大于 0.6 mg/g 时,对ABTS自由基的清除率升高趋势变缓;总皂苷质量浓度为1.0 mg/g时,清除率达到最大值,为96.07%(图5)。
  3 结论
  通过响应面法优化辽东楤木总皂苷提取工艺的最终工艺为液料比20 mL ∶ 1 g,超声时间 60 min,乙醇体积分数85%。在此条件下, 测得辽东楤木总皂苷提取量为94.93 mg/g,实测值与模型预测值无显著差异,说明该方法稳定可靠,为准确测定辽东楤木中总皂苷提取量奠定了基础。辽东楤木中总皂苷抗氧化作用的研究表明,总皂苷具有较强的抗氧化能力,综合比较辽东楤木总皂苷与抗坏血酸分别清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力,总皂苷与抗坏血酸的抗氧化作用有一定的差异,但作为一种天然来源的抗氧化剂,总皂苷具有较好的抗氧化活性。该研究可为辽东楤木保健产品的进一步开发研究提供科学依据[19]。
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