冠突散囊菌发酵夏秋茶工艺优化研究
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作者:张六六 王亚 吴燕
摘要 以自主分离的冠突散囊菌菌（Eurotium cristatum）SL-1为研究对象，对该菌株的固态发酵条件及培养基配方进行了研究。结果表明，以夏秋茶叶作为唯一氮源及发酵基质，SL-1菌株产孢的最佳培养基配方为1%（m/V）葡萄糖+1%（m/V）蔗糖，并添加由KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3组成，终浓度为0.5%的无机盐。最适发酵条件如下：最适温度为25 ℃，最适初始pH为5.0，最适初始含水量为75%，最适接种量为105 CFU/g，最适发酵时间为7 d。在最佳培养基和培养条件下，获得SL-1菌株的最高产孢量（8.25×109 CFU/g），可为后续发酵工艺研究提供数据支撑。
关键词 冠突散囊菌;固态发酵;工艺
Abstract Using E. cristatum SL1 selfisolated as research object， the fermentation conditions and the formula of culture medium were optimized. The results showed that the best medium by using tealeaf as the only nitrogen source and matrix of summerautumn tea were as follows： 1% glucose（m/V）+1% sucrose（m/V）， and adding inorganic salt （composed with KH2PO4+K2HPO4， ZnCl2， MgSO4， CaCl2， MnSO4， FeCl3 ） with the final concentration of 0.5%. The optimal fermentation conditions were as follows： culture temperature 25 ℃， initial pH 5.0， initial water content 75%， inoculation amount of 105 CFU/mL and fermentation for 7 days. Under the optimal medium and culture conditions， the number of viable bacteria reached 8.25×109 CFU/g， which could meet the needs of the subsequent fermentation process.
Key words Eurotium cristatum;Solid fermentation; Process
由于夏秋季節气温普遍偏高，茶树的碳代谢水平高，氮代谢水平低，使得夏秋茶中的多酚类物质含量高，维生素、氨基酸以及芳香成分的含量偏低，制成的茶叶往往口感较差，苦涩味重，缺乏清香气味，品质上远远达不到春茶的水平[1]。同时，茶叶采摘的劳动强度较大，成本高，茶农采摘后无利可图，使得夏秋茶的鲜叶采摘少甚至不采，不仅造成了资源极大浪费，而且消耗土地肥力，同时带来植保问题[2]。因此，如何利用夏秋茶资源对于提高茶叶的生产整体效益、增加茶农的收入十分重要。
冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯砖茶发花过程中的优势菌种[3]，其产生的黄色闭囊壳均匀附着在茯砖茶中，俗称“金花”[4]。目前国内对该菌种的研究主要集中在分类鉴定、形态结构、生长特性以及发花工艺控制方面[5]，对其自身发酵工艺以及发酵产物鲜有研究及报道。
笔者前期从茯砖茶中分离筛选出1株冠突散囊菌E.cristatum SL-1，其在茶叶发酵过程中均有良好的活性及生存优势。笔者对其固态发酵条件进行了优化，采用茶叶作为唯一氮源及固态基质，通过加入一定量的营养物质来补充发酵培养基，以产孢量为考察指标，探究冠突散囊菌E.cristatum SL-1的最佳固态发酵工艺，旨在为该菌种应用于夏秋茶的大规模发酵提供理论依据及数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种。
一株冠突散囊菌菌株DP-1，分离自茯砖茶中。经菌落形态及显微结构鉴定[6]、生理生化鉴定和基因鉴定确定为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）[7]，由江苏省微生物研究所有限公司菌种保藏库保藏。
1.1.2 茶叶。
研究所用茶叶于夏季（7—8月）采自宜兴市晓峰茶厂。
1.1.3 培养基。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，自然pH。
1.1.4 试剂。
红糖购自当地农贸市场，糖蜜购自无锡凯尔化工产品有限公司，其他试剂均购自国药试剂公司。
1.1.5 仪器与设备。
SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;
SW-CJ-1FD洁净工作台（苏州安泰空气技术公司）;
LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）;
81·2型磁力恒温搅拌器（上海曹行无线电元件厂）;
AL104型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;
MP1002型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）;
PHS-3CT实验室pH计（上海今迈仪器有限公司）;
DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）。
1.2 方法 1.2.1 孢子悬液的制备。
取一支已培养4 d的E.cristatum SL-1的斜面试管，在无菌条件下倒入灭菌后的去离子水10 mL，用接种环将黄色闭囊壳刮下，并用已灭菌的滤纸进行过滤，过滤后的悬浮液倒入盛有100 mL无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠振摇20 min，即获得E.cristatum SL-1孢子悬液。
1.2.2 鲜茶叶含水量的测定。
分别准确称取10份茶叶置于培养皿盖中，每份10 g，置于干燥箱内，120 ℃下烘干至恒重，通过烘干前后的重量差值来计算茶叶的含水量。
1.2.3 不同碳源对E.cristatum SL-1菌株生长的影响。
采用组合碳源的方式研究碳源对SL-1菌株生长的影响。根据不同的碳源类型，分别采用以下6种碳源组合进行试验：1%葡萄糖+1%蔗糖、1%葡萄糖+1%红糖、1%葡萄糖+1%糖蜜、1%蔗糖+1%红糖、1%蔗糖+1%糖蜜、1%红糖+1%糖蜜。氮源选择为鲜茶叶、初始含水量为70%、接种量为104 CFU/g。25 ℃下培养5 d后，采用血球计数法统计三角瓶内SL-1菌株的活孢子数。
1.2.4 不同无机盐对E.cristatum SL-1菌株生长的影响。
分别选择KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3 6组无机盐进行试验，以NaCl为对照，各组无机盐的浓度均为0.5%，按“1.2.3”中的最适碳源及其他相同条件培养SL-1菌株，5 d后测定活孢子数。
1.2.5 E.cristatum SL-1菌株最适培养温度的确定。
分别选择20、25、30、35、40 ℃ 5个温度对SL-1菌株进行培养，其他培养条件与“1.2.4”相同。培养5 d后，测定活孢子数，确定DP-1菌株的最适生长温度。
1.2.6 E.cristatum SL-1菌株最适初始pH的确定。
用1 mol/L盐酸或1 mol/L NaOH溶液分别将营养液的初始pH调至4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，其他培养条件与“1.2.5”相同。培养5 d后，测定各初始pH条件下的活孢子数，确定SL-1菌株的最适生长初始pH。
1.2.7 不同初始含水量对E.cristatum SL-1产孢量的影响。
利用营养液或烘干手段，通过计算鲜茶叶的初始含水量，將最终发酵过程中初始含水量分别调整至60%、65%、70%、75%、80%和85%，其他条件与“1.2.6”相同。培养5 d后，测定各初始含水量条件下的活孢子数，确定SL-1菌种的最适初始含水量。
1.2.8 不同接种量对E.cristatum SL-1产孢量的影响。
分别将孢子悬液接种量调至103、104、105、106 CFU/g，接种至固态发酵基质中，其他条件与“1.2.7”相同。培养5 d后，测定不同接种量下的活孢子数，确定SL-1菌种的最适接种量。
1.2.9 不同发酵时间对E.cristatum SL-1产孢量的影响。
按照“1.2.3”～“1.2.8”中获得的最适培养条件，对E.cristatum SL-1菌种进行培养，从第3天开始，每天对其产孢量进行统计，以确定SL-1菌种的最佳发酵周期。
2 结果与分析
2.1 碳源
考虑到成本因素，选用价格低廉、工业应用较为广泛的葡萄糖、蔗糖等原料及红糖、糖蜜等天然物质作为碳源，通过组合的方式研究不同碳源对SL-1菌株生长的影响，结果如图1所示。从图1可以看出，选用1%葡萄糖+1%蔗糖的组合方式作为碳源，获得SL-1菌株的孢子量较其他5种组合更高，测得的活菌数达到4.87×108 CFU/g。因此，SL-1菌株培养的最佳培养基碳源为1%葡萄糖+1%蔗糖。
2.2 无机盐
6组无机盐对DP-1菌株生长的影响如图2所示。从图2可以看出，6种无机盐对SL-1菌株的产孢促进作用均较NaCl有不同程度提高。其中以ZnCl2最为显著，其活菌数达到8.45×108 CFU/g。
由于添加6种无机盐获得的SL-1菌株产孢量都有所提高，表明均是菌株生长所需的无机盐离子，因此该研究将6种无机盐按需求量的比例进行组合，同时添加EDTA等金属离子络合剂，制成终浓度为0.5%的无机盐营养液。采用上述获得的碳源，并将营养液添加至培养基中对SL-1菌株进行培养，5 d后测产孢数结果如图2所示，试验表明添加营养液后SL-1菌株的产孢量有大幅度提高，孢子数达到1.15×109 CFU/g。
2.3 培养温度
不同培养温度对SL-1菌株生长的影响如图3所示。从图3可以看出，当培养温度为25 ℃时，SL-1菌株的产孢量最大。因此，SL-1菌株的最适温度为25 ℃。
2.4 初始pH
不同初始pH对SL-1菌株产孢量的影响如图4所示。从图4可以看出，当初始pH为5.0时SL-1菌株的产孢量最大，因此可确定SL-1菌株的最适初始pH为5.0。
2.5 初始含水量
经测定可知，试验所用的鲜茶叶含水量为70%，不同初始含水量对SL-1菌株产孢量的影响如图5所示。从图5可以看出，不同含水量对产孢量有明显影响。当初始含水量为75%时SL-1菌株产孢量最高，因此SL-1菌株发酵的最适初始含水量为75%。
2.6 接种量
不同接种量对SL-1菌株产孢的影响如图6所示。从图6可以看出，在103～105 CFU/g内，随着接种量的增加，产孢量也逐渐增加，当接种量超过105 CFU/g时对SL-1菌株产孢量几乎没有影响。因此，选择105 CFU/g作为最佳接种量。 2.7 发酵时间
不同发酵时间对SL-1菌株产孢量的影响如图7所示。从图7可以看出，在0～7 d内，SL-1的产孢量随着发酵时间的增加而显著增加，发酵8 d时产孢量却有所降低，原因可能是所产孢子有部分又萌发，8 d后产孢量又开始增加。从日产孢量及效率方面考虑，选用发酵7 d作为SL-1菌株的最佳发酵时间。
3 讨论与结论
近年来，随着茶叶种植面积的增加以及物质生活水平的提高，我国传统茶产业面临供大于求的关系，消费者更趋向于选择高品质的茶叶[8]。夏秋茶由于内含物多酚类物质含量高，很难受到广大消费者的青睐[9]。同时，夏秋茶产量又占用全年总产量的60%以上，利用微生物发酵夏秋茶是一种夏秋茶开发利用的新途径[10]，其发酵产物不仅是养殖动物的良好饲料添加剂，同时也可以作为肥料使用，使得资源可循环利用。
该研究对自主分离筛选的冠突散囊菌E.cristatum SL-1进行发酵夏秋茶条件的研究，确定了SL-1菌株的最适发酵条件：最适温度为25 ℃、最适初始pH为5.0、最适初始含水量为75%、最适接种量为105 CFU/g，最适发酵时间为7 d。
同时，对SL-1菌株的培养基配方进行了初步优化，以夏秋季的鲜茶叶为唯一氮源和固态发酵基质，确定了培养基的最佳碳源为1%葡萄糖+1%蔗糖，并添加由KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3组成，终浓度为0.5%的无机盐。此组合由成本低廉的原料及天然物质组成，营养更为均衡，既有少量的速效碳源供菌株前期快速生长利用，同时又有大量的迟效碳源以保证菌株中后期数量和活力的稳定。
该研究对E.cristatum SL-1菌株的发酵条件及培养基配方仅进行了摇瓶阶段的初步优化，计划下一步通过采用脉动试发酵罐进行放大试验确定发酵的各个参数，为该菌株的工业生产及应用提供理论依据及数据支持。
安徽农业科学 2020年
参考文献
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