无患子总皂苷提取工艺优化及其对酪氨酸酶的抑制活性

来源:用户上传      作者:

　　关键词：无患子;总皂苷;提取工艺;富集工艺;正交试验;酪氨酸酶;黑色素
　　无患子产于长江流域以南[1]，《本草纲目》《鸡肋篇》均有记载，称为肥珠子、油珠子[2]。无患子果皮皂苷成分主要为三萜及倍半萜类，具有较强的表面活性作用[3-4]，含量达5.33%[5]。《本草纲目》中载：洗头去风明目，洗面增白祛斑。在现代中药及天然药物化学研究中认为，无患子中活性物质可以通过对酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互变酶的作用，抑制黑色素的产生，从而达到美白效果。在这其中，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，对酪氨酸酶活性的控制，是美白护理的关键。近年来虽有报道无患子提取物对酪氨酸酶有抑制作用[6-7]，但对无患子总皂苷提取工艺优化及对酪氨酸酶活性抑制作用鲜有新的报道，本研究拟通过优化无患子总皂苷提取工艺、考察无患子皂苷對酪氨酸酶活性的抑制作用，来评价无患子总皂苷美白护肤的作用效果，为无患子在美白护肤化妆品的工业化生产提供可行性方案。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验仪器与材料
　　试验仪器：药物天平（JYT-2，上海医用激光仪器厂）;电子天平[AL-204，梅特勒-托利多（上海）有限公司];超声提取器（SY-360，上海宁商超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（WMZK-72，上海跃进医疗器械厂）;电热鼓风干燥箱（DHG-9035A，上海源长实验仪器设备厂）;恒温水浴锅（HH-S6，天津先权有限公司）;酶标仪（SpectraMax PLus-384，美谷分子仪（上海）有限公司）旋转薄膜蒸发仪（R-3001，郑州长城科工贸有限公司）。
　　试验材料：无患子（2018年12月购于海宁市盐官苗木合作社，产于浙江）由长春中医药大学董金香教授鉴定;酪氨酸酶（25 000 mg，Sigma公司）;DOPA（Sigma公司）;磷酸缓冲盐（北京化工有限公司）;熊果苷标准品（批号：110742-201620，中国药品生物制品检定所）。大孔吸附树脂D101（上海恒远生物技术发展有限公司）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 无患子总皂苷提取工艺优化
　　1.2.1.1 标准曲线建立 精确称取齐墩果酸标准品12.5 mg，甲醇定容至50 mL，配制成为 0.25 mg/mL 齐墩果酸标准品溶液，待用。分别精确量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL配制好的齐墩果酸标准品溶液置于比色皿中，70 ℃下水浴蒸干溶液，将蒸干后各比色皿中分别加入3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 mL 60% H2SO4溶液，充分振荡，摇匀。将得到溶液于60 ℃恒温水浴中加热15 min，冷却后静置15 min，待测。以空白溶液为参比，于520 nm波长处测定各组样品的吸光度[8-9]。以测得结果的吸光度为纵坐标和对应的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。
　　1.2.1.2 单因素考察
　　1.2.1.2.1 乙醇浓度考察 称取无患子果皮30 g，料液比为1 g ∶ 10 mL提取时间，为30 min条件下，将乙醇浓度设定为10%、30%、50%、70%、90%，分别进行提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较。
　　1.2.1.2.2 提取时间考察 称取无患子果皮30 g，以10%乙醇为提取溶剂，在35 ℃料液比为 1 g ∶ 10 mL 条件下，将提取时间设定为30、60、90、120、150 min，分别提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较。
　　1.2.1.2.3 料液比考察 称取无患子果皮30 g，以10%乙醇为提取溶剂，在35 ℃提取30 min条件下，将料液比（g ∶ mL）设定为1 ∶ 10、1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 90，分别提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较[10-12]。
　　1.2.2 正交试验设计 试验选择超声提取法进行无患子总皂苷的提取。按L9（34）正交表进行试验，选择提取溶剂浓度、提取时间、料液比为考察因素（表1），选择无患子总皂苷含量为考察指标设计试验。
　　1.2.3 验证性试验 按照“1.2.2”节下所得最优提取方案连续提取3次，通过3次总皂苷得率结果，考察最优方案的稳定性。
　　1.2.4 酪氨酸酶抑制率测定方法
　　1.2.4.1 样品制备 称量1 000 g无患子果皮粉末，使用所得的最佳工艺提取无患子总皂苷，浓缩提取液，蒸干提取液成干膏，备用。
　　1.2.4.2 大孔树脂吸附富集 取3份最优方案提取总提取物，每份取10 g，分别定容至50 mL容量瓶中。准确量取已经预处理的D101大孔树脂200 mL 3份，湿法装柱分别标号：Y-1（水-D101）、Y-2、Y-3，分别上样10 g提取物，依次以蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各3倍体积量依次洗脱。收集洗脱液，挥干溶剂，制成干膏，分别称质量，待用[13]。
　　1.2.4.3 有机试剂萃取 取“1.2.4.1”节下制得总提取物10 g，溶于100 mL蒸馏水中，转入分液漏斗，依次分别加入100 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（水饱和）萃取，分别收取萃取液及萃取后所得水层，于50 ℃下分别减压浓缩干燥，制成干膏，称质量后待用。
　　1.2.4.4 试验溶液配制
　　1.2.4.4.1 供试品溶液配制 取“1.2.4.2”“1.2.4.3”节下制得的干膏各5 mg，用磷酸缓冲液分别定容至5、10、25 mL容量瓶中配成1、0.5、0.25 mg/mL 质量浓度的溶液待用作为供试品溶液。
　　1.2.4.4.2 阳性对照溶液配制 取熊果苷标准品5 mg，依照“1.2.4.4.1”节方法配制成为1、0.5、025 mg/mL的溶液作为阳性对照待用。 　　1.2.4.5 检测方法 精确吸取不同质量浓度试验溶液、分别依次按照表2将试验溶液加入于96孔板中A、B、C、D中，置于酶标仪中，并于450 nm处测吸光度，得出不同样品溶液的抑制率作比较。依据公式计算酪氨酸酶的抑制百分率[14]：抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 标准曲线建立结果
　　试验结果见图1，按“1.2.1.1”节下方法建立标准曲线，结果显示：y=0.613x-0.059 5，r2=0.999 1，齐墩果酸在0.125～0.875 mg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。
　　2.2 提取工艺条件考察
　　2.2.1 单因素考察试验结果 以无患子总皂苷含量为参考指标，分别对影响总皂苷提取率的乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次數等试验因素作为研究对象，按照“1.2.1.2”节下试验考察上述因素。
　　2.2.1.1 乙醇浓度对无患子总皂苷提取得率的影响 保持其他因素不变，考察无患子果皮提取时提取溶液乙醇浓度对总皂苷得率影响，结果如图2所示。随着提取溶剂中乙醇浓度不断增加，总皂苷得率与乙醇浓度呈正相关，当提取液乙醇浓度高于50%时，总皂苷得率呈下降趋势，而当乙醇浓度在40%～60%时，总皂苷得率较高且得率较接近，因此，综合考虑试验成本，应当考察乙醇浓度为40%、50%、60%时乙醇浓度对无患子总皂苷提取得率的影响。
　　2.2.1.2 提取时间对无患子总皂苷提取得率的影响 保持其他因素不变，考察无患子果皮提取时提取时间对总皂苷得率影响，结果如图3所示。随着提取时间的不断增加，在0～1.5 h时间范围内总皂苷提取率与提取时间呈正相关，当提取时间超过15 h时，总皂苷提取率没有明显降低，因此，综合考虑试验成本，应当考察提取时间为0.5、1.0、1.5 h时，提取时间对无患子总皂苷提取得率的影响。
　　2.2.1.3 料液比对无患子总皂苷提取得率的影响 保持其他因素不变，考察无患子果皮提取时料液比对总皂苷得率影响，结果如图4所示。当料液比为 1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL时总皂苷得率随提取液增加而提高，呈现这种规律的原因是随着提取溶剂比例增加，无患子果皮中活性物质逐渐从细胞内部溶出并扩散到溶液中。当料液比为 1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 90 mL时总皂苷得率呈下降趋势。综上，考虑到试验成本及总皂苷提取效果，选择料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL 时，提取料液比对无患子总皂苷提取得率的影响。
　　2.3 正交试验结果
　　试验结果（表3、表4）表明，在正交试验结果表（表3）中 RA>RC>RB，因此，无患子总皂苷提取率影响因素从大到小依次为：溶剂浓度>料液比>提取时间，根据直观分析对于A因素提取溶剂浓度 k3>k2>k1;对于B因素提取时间k3>k1>k2;对于C因素料液比k3>k2>k1;可得出最佳提取工艺为A3B3C1，即：以60%乙醇为提取溶剂，提取时间 1.5 h，料液比1 g ∶ 30 mL进行提取。
　　2.4 验证试验
　　对筛选后的提取工艺进行3次验证试验， 提取率分别为8.76%、8.71%、8.89%，RSD值为106%，表明本试验确定的提取工艺稳定、可行。
　　2.5 对酪氨酸酶的抑制活性
　　由表5可以看出，2种不同富集方式总皂苷得率不同，各组分得膏率顺序如下：水饱和正丁醇得膏率>Y-3（70%乙醇）>H2O>Y-1（水-D101）>Y-2（30%乙醇）>乙酸乙酯>石油醚，在考察各个样品体外对酪氨酸酶抑制活性时，不同富集方式得到的样品抑制率有显著不同，如表6所示，在初始质量浓度（0.25 mg/mL）下，各样品抑制率较接近，无明显区别，在中间质量浓度（0.5 mg/mL）下，较其他样品，熊果苷对酪氨酸酶抑制作用最强，其抑制率为46.77%，石油醚次之，其抑制率为4482%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率为4462%，在高质量浓度（1 mg/mL） 时，各样品对酪氨酸酶抑制活性基本与中间浓度时表现一致，其中熊果苷对酪氨酸酶抑制作用最强，其抑制率为84.69%，石油醚次之，其抑制率为81.25%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率为8022%。但石油醚得率较低，考虑成本问题，D101大孔树脂富集法70%乙醇洗脱更经济实用，综上，无患子果皮提取物表现出较强的酪氨酸酶抑制活性，因此，可作为美白产品添加剂，综合考察得膏率及抑制率，通过大孔树脂D101，70%乙醇洗脱后得到总皂苷对酪氨酸酶活性抑制效果最好，因此，可选此工艺为无患子总皂苷富集工艺。
　　3 讨论与结论
　　酪氨酸酶在人体皮肤黑色素生成系列反应中具有重要的生理功能，抑制酪氨酸酶活性可以阻断人体皮肤黑色素形成，从而起到美白皮肤的效果，本试验以天然药物无患子为研究对象，优化无患子总皂苷提取、富集工艺并合理评价无患子总皂苷的体外酪氨酸酶抑制效果。
　　在无患子提取工艺研究中，分别对影响无患子总皂苷提取得率的因素：乙醇浓度、提取时间、料液比进行单因素考察试验，并以无患子总皂苷得率为参考指标，通过正交设计优化得到无患子总皂苷提取工艺为：提取溶剂为60%乙醇，提取时间为 1.5 h，料液比为1 g ∶ 30 mL，经试验验证此方法稳定可靠。
　　本试验不仅对无患子总皂苷提取工艺进行优化，还进一步考察了无患子提取物体外酪氨酸酶抑制活性。为提高无患子提取物的应用效率，又分别对无患子提取物进行2种纯化方式下的得膏率和酪氨酸酶活性抑制作用的考察。水饱和正丁醇组得膏率相对较高，为43.12%，但其对酪氨酸酶抑制活性相对较差，因此不选作较优的富集方案;石油醚层组分虽相同质量浓度下对酪氨酸酶抑制活性与熊果苷接近，但由于其得膏率较低，不作选择，考虑到成本问题遂选择无患子提取物通过大孔树脂D101、70%乙醇洗脱方法对无患子提取物进行富集纯化。纯化后无患子总皂苷提取物利用效率更高，对酪氨酸酶抑制活性更强，能更好地发挥无患子的美白功效。 　　参考文献：
　　[1]刘玉壶，罗献瑞. 中国植物志（第四十七卷第一分册）[M]. 北京：科学出版社，1998.
　　[2]张敏杰，刘佩茹，赵俊滋，等. 无患子的开发利用[J]. 天然产物研究与开发，1993，12（4）：76-79.
　　[3]李 锐，周 燕，杨永成，等. 无患子皂苷成分的串联质谱分析[J]. 高等学校化学学报，2006，27（1）：52-54.
　　[4]解 辉. 无患子总皂苷分离纯化的研究[M]. 合肥：合肥工业大学，2008.
　　[5]杨志斌，杨 柳，李 晖. 无患子有效化学成分的分析研究[J]. 湖北林业科技，2010，22（5）：32-34.
　　[6]赵志敏，南艳平，唐青涛，等. 无患子总皂苷抗炎及抑制酪氨酸酶活性研究[J]. 时珍国医国药，2014，25（7）：1592-1595.
　　[7]陈清西，宋康康. 酪氨酸酶的研究进展[J]. 厦门大学学报（自然科学版），2006，45（5）：731-737.
　　[8]陈莎莎，陈丽萍，林继辉. 无患子果皮皂苷提取工艺研究[J]. 云南民族大学学报（自然科学版），2019，28（6）：558-562.
　　[9]冯月燕，李智斌. 天然无患子总皂苷提取工艺研究[J]. 广东化工，2019，46（9）：128-129.
　　[10]张永忠，徐建军，叶玉杰. 无患子果皮皂苷提取及天然洗手液制备研究[J]. 亚太传统医药，2017，13（14）：34-36.
　　[11]马丽珍. 无患子皂苷提取工艺的优化[J]. 日用化学工业，2015，45（3）：149-151.
　　[12]李智斌，张彦焘. 无患子总皂苷表面活性及其含量测定方法的研究[J]. 广东化工，2019，46（9）：124-125.
　　[13]陈 雷，赵春琳，周生学. 无患子总皂苷体外抑制酪氨酸酶活性的研究[J]. 安徽农业科学，2015，43（21）：56-58.
　　[14]赵志敏，南艳平，唐青涛，等. 无患子总皂苷抗炎及抑制酪氨酸酶活性研究[J]. 时珍国医国药，2014，25（7）：1592-1595.赵玥琪，郝婧玮，王 颖. HPLC法评价储存温度对茶葉中3种儿茶素含量的影响[J].
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15252828.htm