养殖牙鲆致病性弧菌的鉴定及药敏分析

来源:用户上传      作者:高杨

　　摘 要：2020年丹东东港市某养殖厂养殖1龄牙鲆（Paralichthys olivaceus）突发病害，表现为腹水病症状。取患病的5尾养殖牙鲆的鳃、肝、脾、肠道、腹水为材料进行细菌分离及纯培养，选择优势菌株通过全自动细菌分析仪及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定，结果表明分离纯培养的14株菌（DS200401-DS200414）共鉴定出2种，其中1种为该病的致病菌：弧菌属灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。随后进行人工感染试验和药敏试验。用12种抗菌药物对3种菌进行药敏试验， 结果显示在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。
　　关键词：牙鲆（Paralichthys olivaceus）;灿烂弧菌（Vibrio splendidus）;药敏试验
　　丹东东港市8 667 hm2（13万亩）海水池塘普遍采用多品种立体生态养殖模式[1]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）作为混养的重要海水低温经济品种[2]，属于蝶形目（Pleuronectiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆属（Paralichthys），由于肉质鲜美，深受消费者喜爱。在牙鲆养殖过程中，由于操作管理不当和投喂冷冻野杂鱼的养殖方式，增加了细菌感染的风险，常常导致细菌病爆发，造成巨大的经济损失，制约牙鲆养殖业的发展。2020年丹东东港市某养殖场大面积暴发牙鲆腹水病，主要病原是灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。笔者对该养殖场患病的1龄牙鲆的鳃、肝、脾、肠道、腹水进行细菌分离与鉴定，对分离出的致病菌进行了16S rDNA序列分析、药敏试验，为养殖牙鲆的病害研究提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　2020年4月东港市某牙鲆养殖户反映，患病牙鲆表现为体色发黑，眼球突出，腹水严重，直至全部感染。送检的5尾濒死牙鲆，体长约25.31～29.86 cm。健康牙鲆取自东港市某养殖场。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 肉眼检查及剖检 肉眼观察患病牙鲆的体表症状，解剖病鱼，对鳃组织进行镜检，并记录。
　　1.2.2 细菌分离 在无菌条件下，取患病的1龄牙鲆的鳃、肝、脾、肠道、腹水进行细菌分离与鉴定，用接种环接种于2216E琼脂海水培养基和硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）培养基上[3-4]，划线分离，28 ℃恒温培养箱培养24 h，挑取优势菌的单菌落，在胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平板上纯化培养。
　　1.2.3 细菌鉴定
　　1.2.3.1 分子生物学鉴定 对分离菌株进行常规16S rDNA基因序列鉴定，将得到的产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对。选取同源性较高的序列，采用 Clustal X 1.83软件进行多重序列比对分析，并通过MEGA 6软件采用邻接法构建系统发育树。
　　1.2.3.2 生化鉴定 采用法国生物梅里埃公司生产的微生物自动分析系统进行生化特征分析。
　　1.2.4 人工感染试验 试验牙鲆为东港地区某养殖场健康牙鲆10尾，体长8～10 cm，暂养于两个200 L水族箱中，温度控制在15 ℃，充氧并少量投食。试验组与对照组各10 L水体分别放入5尾牙鲆，采用注射感染[5]方法，每尾鱼注射0.05 mL约108 cfu/mL的菌悬液，对照组注射 0.05 mL无菌生理盐水。观察记录发病症状及死亡情况。
　　1.2.5 藥敏试验 对所分离并经鉴定的菌株，采用[6]琼脂扩散纸片法（K-B）进行对常用抗菌类药物的敏感性测定。
　　2 结果与分析
　　2.1 发病情况及主要病变
　　2020年4月东港市某牙鲆养殖场反映，3月20日左右，十余家养殖户养殖的1龄牙鲆，经室内越冬池转移到室外土池塘时，均出现鱼体发黑，眼球突出，腹部膨大，停止摄食最终死亡。共计养殖牙鲆100万尾，病死率高达67.6%。送检的5尾患病牙鲆，体长约25.31～29.86 cm，鳃丝完好，1尾体表有溃烂，解剖后5尾鱼存在白色混浊腹水，肝脏脾脏肿大，肠壁出现充血水肿，肠道内无食物且充满淡黄色黏液，1尾肠道内有白色线团状物。
　　2.2 病原形态特征
　　取病鱼的鳃、肝、脾、肠道、腹水进行细菌分离与鉴定，从鳃上分离出一株细菌，只在2216E平板上生长，形成圆形光滑，边缘整齐突出，白色较小的菌落。在脾脏、肠道、腹水中分离出的细菌，同时生长于2216E平板和TCBS平板，形成圆形光滑，黄色突起的菌落，大小有差异。革兰氏染色后在显微镜下观察为革兰氏阴性菌。
　　2.3 病原菌的生理、生化鉴定
　　由全自动细菌分析仪对病原菌的生理生化检测结果可知，该病原菌初步鉴定为弧菌属细菌。
　　将分离菌所扩增的16S rDNA基因序列进行Blast比对结果显示，从鳃上分离出的菌株 DS200401为肠杆菌。从脾脏，肠道，腹水中分离出的菌株DS200404、DS2004008、DS2004013基因与灿烂弧菌（Vibrio splendidus）相应基因相似率达98%。分离菌所扩增的16S rDNA基因序列提交到GenBank，获得序列号为MT445177-MT445179，所构建的系统发育树见图1，菌株与灿烂弧菌聚为一支。
　　2.4 人工感染试验
　　试验组的5尾牙鲆鱼感染后的4～5 d死亡2尾，发病3尾，解剖观察肝脏脾脏出现肿大，肠道有黄色黏液，3尾鱼有腹水。对发病牙鲆进行细菌分离鉴定，结果与原感染菌一致 。 　　2.5 药敏试验
　　药敏试验结果显示，三株细菌DS200404、DS2004008、DS2004013对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等抗生素敏感，对青霉素、制霉菌素耐药（表1）。不同菌株间耐药差异不明显。
　　3 讨论
　　作者首次从丹东地区患病的牙鲆体内分离出三株菌，并命名为DS200404、DS2004008、DS2004013。经鉴定均为灿烂弧菌。该菌是刺参腐皮病[7-9]的主要病原，感染牙鲆的文章还未见报道。通过人工感染试验可知，该菌是致病菌，也是牙鲆细菌病的主要病原之一。
　　牙鲆弧菌病發于春夏季节[4，5，10]，尤其早春季节危害最为严重 。养殖牙鲆经历越冬期后，免疫力较低，放入土池后，由于环境改变，易发生细菌感染;池塘清池时若残留漂白粉等药物，易造成牙鲆药物中毒;传统的投喂冷冻野杂鱼的养殖方式[11]，增大了牙鲆细菌感染的风险。
　　由药敏试验结果可知，灿烂弧菌对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等6种抗生素敏感。在防治水产生物细菌性疾病时不要滥用[12]抗生素类药物，避免细菌耐药性的产生，增加病害控制的难度。确定药物的最低有效浓度及菌株的耐药性是下一步工作的方向。
　　通过以上检测结果可知，此次牙鲆鱼养殖池暴发的腹水病主要病原是灿烂弧菌，建议养殖户在养殖过程中保证良好水质，选择优质饵料，提高鱼体抗病力，并用配合饲料替代冷冻野杂鱼降低感染风险。
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　　（收稿日期：2020-06-02）
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