一株鸭源大肠杆菌的分离、鉴定和耐药性分析

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　　摘 要：以嘉兴海宁地区鸭场送检的4份病料（脑组织、肝脏、脾脏等）为材料，通过增菌及分离培养获得疑似大肠杆菌1株;进一步通过革兰氏染色镜检及PCR检测，鉴定阳性1株;对分离得到的菌株进行药敏试验，结果显示，分离菌株对庆大霉素、丁胺卡那2种药物高度敏感。
　　关键词：鸭源大肠杆菌;分离鉴定;耐药性
　　中图分类号 S852.61+2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）15-0099-03
　　大肠杆菌是目前对养鸭业危害最为严重的高致病性细菌之一，其血清型众多且分布广泛。各养殖场通常使用抗生素来预防和治疗大肠杆菌病，但长期大量不合理的使用导致大肠杆菌耐药频谱不断扩大，甚至有些菌株已面临无药可用的现状。因此，有必要根据不同地区甚至相同地区不同养殖场的大肠杆菌流行现状，规范、合理使用抗生素。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 病料 送检的疑似病例来自海宁地区的养鸭场，经过无菌操作采集病死鸭的脑、肝脏及心脏等器官备用。
　　1.1.2 培养基和试剂 麦康凯培养基（MacC）、LB液体培养基、生化鉴定管均购自上海博微生物科技有限公司，DNA Marker DL 2000、10×Loading buffer为大连宝生（Takara）生物工程公司产品，Gel Red核酸染料购自上海生工生物科技有限公司，50×TAE電泳缓冲液购自上海碧云天生物科技有限公司，引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司。
　　1.1.3 药敏试纸 试验使用的抗生素药敏试纸（共包含10种抗生素，为氯霉素、复方新诺明、头孢唑啉、诺氟沙星、红霉素、庆大霉素、丁胺卡那、环丙沙星、氨苄青霉素、青霉素）购自杭州微生物试剂有限公司，Premix Taq酶订购于宝生生物技术（北京）有限公司。香柏油为上海懿洋仪器有限公司生产，革兰氏染色液购自杭州微生物试剂有限公司，抗菌药物药敏纸片为杭州微生物试剂有限公司生产。
　　1.2 方法
　　1.2.1 大肠杆菌的分离纯化 无菌操作采集病死鸭的脑、肝脏以及心包液等器官，将其接种在新制的麦康凯平板上，置于恒温振荡培养箱中于37℃有氧培养24h。观察细菌的生长情况，并挑取疑似大肠杆菌的单菌落于麦康凯平板上进行划线培养，置于恒温培养箱中37℃培养24～48h。观察平板中细菌生长情况，可见到针尖大小、紫红色菌落，再挑取单个菌落作进一步纯化培养。纯培养物进行MacC平板划板纯化，37℃培养24～48h作初步鉴定。挑选疑似大肠杆菌的纯菌落接种于LB液体培养基上，放入恒温振荡培养箱中于37℃培养24h，观察菌液并与麦氏标准比浊管比浊，确定浑浊度以确定细菌活性。此菌液用于PCR鉴定。
　　1.2.2 革兰氏染色 选取于4℃冰箱中生长旺盛的平板，使用洁净接种环于平板中挑取明显菌落中大肠杆菌进行革兰氏染色。首先于载玻片上滴1滴无菌水，将环上菌体于水中搅拌数次，然后在酒精灯火焰上方通过5～6次以杀灭菌体并将水分蒸干。液体蒸干后滴加结晶紫染料，1min后将玻片倾斜45°用纯净水冲洗干净多余染料，并用滤纸吸干多余水分。滴加碘溶液至玻片中心，静置1min，用纯净水冲洗并用滤纸吸干多余水分，然后用95%乙醇溶剂进行脱色漂洗。下衬白纸，待无有色液体洗出后停止加入乙醇，并用无菌水洗去过量的乙醇溶剂，然后用纯净水冲洗干净。使用番红染色剂染色2min后用纯净水冲净并吸干多余水分。如此重复6次得到大肠杆菌的革兰氏染色片。
　　1.2.3 生化试验 将纯化的菌株接种到肠杆菌科细菌生化鉴定管，37℃培养24h。
　　1.2.4 PCR检测 （1）引物的设计与合成：根据GenBank中大肠杆菌外膜蛋白A编码序列的保守区域设计特异性引物，引物序列设计见表1。（2）反应体系的配置：以上述步骤获得的菌液作为模板进行菌液PCR检测，按照使用说明配制PCR反应体系。（3）反应程序设置：PCR反应体系设定完成后，按照表2中程序设定PCR仪程序。（4）凝胶电泳成像：以提取的大肠杆菌质粒DNA为模板，扩增大肠杆菌基因，并通过凝胶电泳检测。首先观察电泳槽的水平情况，通过调节脚垫旋钮将电泳槽置于水平面上。此后在30mL 1×TAE电泳缓冲液中称取0.24g琼脂糖，将琼脂糖颗粒在微波炉中完全溶解，冷却至50℃时加入10×上样缓冲液，混合并倒入橡胶板中并放置梳子，凝固后除去。然后将PCR反应产物与溴酚蓝混合并依次加到固化的凝胶孔中。在PCR反应结束后，设定120V、100mA于1×TAE电泳缓冲液中电泳，胶体右侧滴加marker。最后将电泳检测扩增条带置于凝胶成像系统中成像并记录。
　　1.2.5 药敏试验 吸取摇床37℃培养的液体培养基中菌液于麦康凯培养基中涂覆3次，每次旋转60°，最后涂覆一周以确保足够均匀。37℃培养12h，用生理盐水稀释至与麦氏标准比浊管浊度相同的浓度，然后置于琼脂平板上晾干后倒置保存。用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作3次。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，两纸片间距不小于24mm，纸片距平板边缘不小于15mm。将药物敏感试纸置于培养基表面并压紧。每只平板等间距放置5张药敏试纸。于37℃恒温箱培养24h观察结果。最后，参照CLSI药敏性试验标准中关于杆菌科的标准，在保证试验结果无明显误差的情况下，用游标卡尺测量抑菌圈直径，获得分离菌敏感性试验结果。
　　2 结果与分析
　　2.1 大肠杆菌分离鉴定及镜检结果 所得的菌株在37℃划线上的麦康凯板并培养20h。MacC琼脂上可以看到紫红色干菌落，形状具有倒圆的起伏，表面平整、湿润，边缘圆滑，直径3mm左右，为典型的大肠杆菌菌落特性。挑取典型菌落接种于培养基上纯化培养。从培养基中挑取菌体加入新制成的LB液体培养基中，盖上硅胶塞后置于摇床上160r/min、37℃振荡培养24h。次日观察菌种均在LB液体培养基中正常生长呈浑浊状态，且试管底部出现絮状沉淀。在100×10倍油镜下观察：所提取菌种为革兰阴性G-，镜中菌体成短小钝头细杆状，单个生长或成对出现，未发现芽孢或荚膜。 　　2.2 生化试验结果 该细菌能够发酵甘露醇、葡萄糖、乳糖和麦芽糖，产酸产气;发酵蔗糖，不产气;MR试验、吲哚试验阳性;硫化氢试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验和尿素酶试验为阴性。生化试验结果符合大肠杆菌的生化特性。
　　2.3 PCR鉴定 按上述PCR反应条件和程序设定，对提取到的菌体进行PCR后与上样缓冲液混合，将其滴入电泳凝胶孔洞中，最右侧孔道中滴加Marker。设定电泳仪120V、100mA，于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳20min，将电泳凝胶置于荧光成像系统中观察，菌体出现大小与浓度接近的250bp目的基因片段（见图1），因此PCR结果确定菌体为大肠杆菌。
　　2.4 药敏试验结果 根据美国临床实验室标准化协会的相关标准，获得大肠杆菌敏感性试验结果（表3）：分离菌对庆大霉素、丁胺卡那2种药物高度敏感;对其他8种药物低敏感度或不敏感。
　　3 結论与讨论
　　鸭大肠杆菌病感染鸭后可引发气囊炎、关节炎、腹膜炎、心包炎等疾病，严重影响禽畜类生长和发育，甚至导致死亡，尤其在大规模养殖企业频发，导致经济效益下降。在本地鸭群饲养过程中，鸭大肠杆菌病与其他病菌交叉感染并相互影响，病症出现多发性的特异性，给防范和防治带来较大困难。本试验筛选出对该养殖场大肠杆菌高度敏感的2种药物庆大霉素和丁胺卡那，能够预防和治疗大肠杆菌病。
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