木薯粉浓醪发酵酒精的研究

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　　摘      要： 濃醪发酵技术具有可以提高发酵强度、缩短发酵时间、节约一次水的用量、提高设备利用率等诸多优势。高性能液化酶、糖化酶和高效优良酵母技术的开发，为解决浓醪发酵过程中黏度高带来的物料输送困难、传质传热效率低下和高渗透压影响酵母生长繁殖问题提供了可能，提高了木薯浓醪发酵酒精技术的可行性。本文对高性能酿酒酵母进行木薯浓醪同步糖化发酵研究，确定了最佳发酵条件为：接种量30%、氮源添加量为2.45 kg/t木薯。同时，筛选出NWTU1糖化酶和抑菌效果好的抑菌剂A，解决了浓醪同步糖化定量供糖的问题，实现了浓醪发酵酒分达到15%以上，残糖含量也达到发酵结束指标。通过酒母培养工艺的研究，确定酒母培养的外观糖为11～13oBx，解决了浓醪发酵过程渗透压高不利于酵母生长、酒母质量差的问题。
　　关  键  词：木薯;糖化酶;浓醪发酵
　　中图分类号：TQ 920.6       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）05-0969-04
　　Abstract： High gravity fermentation technology can improve the fermentation intensity， shorten the fermentation time， save the amount of primary water， improve the utilization of equipment. With the development of high-performance liquefying enzyme， saccharifying enzyme and high-efficiency yeast technology， it is possible to solve the problems of difficult material transportation， low efficiency of mass transfer and heat transfer and high osmotic pressure affecting yeast growth and reproduction caused by high viscosity in the process of high-density mash fermentation， as well as increase the feasibility of cassava thick mash fermentation alcohol technology. In this paper， the simultaneous saccharification of cassava and high-performance Saccharomyces cerevisiae was studied. The optimal fermentation conditions were determined as follows： 30% inoculum amount， nitrogen source 2.45 kg/t（cassava powder）. NWTU1 saccharifying enzyme and bacteriostatic agent A with good bacteriostatic effect were screened out. The problem of simultaneous saccharification and quantitative sugar supply of high-performance Saccharomyces cerevisiae was solved. The liquor content of high-performance fermentation was over 15%， and the content of residual sugar reached the fermentation end index. Through the study of the culture technology of the mother of wine， the appearance sugar of the mother of wine culture was determined to be 11～13obx， which solved the problem that high osmotic pressure was not conducive to the growth of yeast and the quality of the mother of wine was poor.
　　Key words： cassava; Saccharifying enzyme; high gravity fermentation
　　酒精是国民经济中的重要物质，应用于生物能源、化工生产、医药等诸多领域[1]。生物能源燃料乙醇可以替代成品油[2-4]，利用非粮木薯生产燃料乙醇[5-6]符合国家能源产业政策要求。
　　浓醪发酵就是发酵过程中的高浓度醪液发酵，其浓醪发酵的特点具体表现为高渗透压、高酵母数、高产酒率等。浓醪发酵技术的应用可使企业在获得最大产率的同时，提高企业生产能力，降低生产成本。酒精浓醪发酵意义在于[7-10，16，17]：
　　一是在有限空间增加发酵浓度，达到增加发酵强度和提高产能的目的。
　　二是降低能耗，提高成熟醪酒分，生产系统中单位产品所消耗水电汽随之降低，达到降低生产成本的目的。
　　三是酒精精馏提纯过程中，醪液酒分越高，精馏单位产品废醪液残留的酒分损失总量就越少，提高产品收率。 　　四是醪液酒分提高，单位产品所产生的废醪减少，提高了饲料回收率，降低污水处理量，实现清洁生产，达到可持续发展的目的。
　　本文主要研究了木薯浓醪发酵技术，开发了木薯高酒分生产关键技术工艺包。
　　在进行浓醪发酵[9-14]时，醪液高渗透压和高酒精浓度会限制酵母菌的生长繁殖[15-19]，从而对酒精发酵产生强烈的抑制作用。因此，酵母的选择和发酵工艺的改进是进行浓醪同步糖化发酵[13-15]的关键，而以木薯为底物的浓醪发酵工艺并不多见。
　　1  实验部分
　　1.1  材料与试剂
　　木薯，广西地区种植加工的干片;a-淀粉酶（10万U/g），诺维信（中国）生物技术有限公司;葡萄糖水解酶（10 万U/g），诺维信（中国）生物技术有限公司;尿素，安徽金禾化工有限公司;酸性蛋白酶（10 万U/g），山东萍聚生物科技有限公司;安菌泰，柳州龙泰科技有限公司;酵母，广西科学院选育的一种高性能酿酒酵母;葡萄糖，廣西柳州亿炫化工有限公司;盐酸，济南坤丰化工有限公司;硫酸，广西银泉化工有限责任公司;氢氧化钠、次甲基蓝指示剂、斐林试剂、酚酞指示剂，广西天地扬生物科技有限公司。
　　1.2  仪器与设备
　　数码生物显微镜，南宁启博仪器设备有限公司;50 L三联发酵罐，上海百仑生物科技有限公司;AL204分析天平，南宁启博仪器设备有限公司;DL-1万用电炉，上海乔跃电子科技有限公司;S40pH计，上海增骏实业有限公司;HH-8数显恒温水浴锅，上海博迅医疗生物仪器股分有限公司。
　　1.3  实验方法
　　1.3.1  高性能酿酒菌株发酵效果试验
　　通过对不同比例混配酵母发酵效果或单一品种酵母发酵效果进行研究，对比其酒母罐的酸度、酵母数、死亡率以及杂菌数和发酵成熟醪中酸度、残总糖等指标，最终筛选出适用于木薯粉浓醪发酵酒精的优良酵母菌种。试验条件为：液化醪固形物含量≥30%（wt）， pH=4.40～4.60， 接种量25%～30%，尿素添加量1.30 kg/t原料，糖化酶添加量1.0 kg/t原料，安菌泰添加量5 μg/g，发酵温度32～33 ℃，发酵时间48 h。
　　1.3.2  酒母梯度浓度培养工艺的研究
　　通过优选适合于木薯粉浓醪发酵的耐高酒分、耐高渗透压、副产物低的酵母菌株或酵母组合菌株，并优化酒母培养工艺，解决浓醪发酵酒母质量差问题。
　　1.3.3  不同糖化酶对发酵效果的影响
　　通过研究糖化酶对浓醪发酵的影响，探讨通过工艺控制来定量供糖，使发酵醪中的单糖浓度维持在较低的水平，以降低渗透压高对发酵造成的负面影响。确定浓醪同步糖化发酵的最佳工艺，解决糖化率不稳定、杂菌污染严重、发酵成熟醪酒分不稳定等问题。
　　1.3.4  酒母接种量对发酵效果的影响
　　研究了酒母接种量在20%～50%范围内时，不同接种量对耗糖速度、酵母生长情况以及产酒率的影响。
　　1.3.5  尿素添加量对发酵效果的影响
　　取一定量的液化醪，添加糖化酶（1.20 kg/t木薯）、抑菌剂（5 μg/g）、酒母（30%）以及不同量的尿素，然后在30～33 ℃条件下发酵。通过对成熟醪产酒率、酵母生长情况以及尿素添加成本进行分析，来确定尿素最佳添加量。
　　1.3.6  抑菌剂的筛选
　　取车间一定量的液化醪，依次添加尿素（2.45 kg/t木薯）、抑菌剂、糖化酶（1.2 kg/t木薯）、酒母（30%），然后在32～33 ℃条件下进行发酵。最终通过实验，对比分析发酵醪中的挥发酸、酸度、升酸差、酵母情况、酒分等指标，评价不同类型抑菌剂的抑菌效果。
　　1.3.7  分析检测
　　采用酶解法测定淀粉含量;采用斐林试剂热滴定定糖法测定还原糖、总糖的含量;采用血球计数板法检测酵母质量;采用酒精厂常用方法测定外观糖度、酒精度、挥发酸、酸度等。
　　2  结果与讨论
　　2.1  高效酵母的筛选和适宜的混合比例的确定
　　在浓醪发酵过程中，选育耐高酒分、耐高渗透压、低副产物的优良酵母菌株可以大幅度提高发酵产酒能力。
　　单一酵母与复配酵母发酵成熟醪比较结果见图1。不同比例的酵母B与酵母A混合，酵母B的添加量越大，在同样发酵条件下，成熟醪还原糖降低，酵母后发酵力强，酒分越高，酸度越低，发酵效率越高。但是B酵母添加比例超过30%时，则会降低前期发酵速度。因此，B酵母与A酵母菌株最佳比例为30%B+70%A。
　　传统酒精发酵时间一般要60 ～70 h [6]，而从图1可看出，酵母在发酵48 h后酒分就超过了15.0 %，残糖含量也达到发酵结束指标，说明使用该酵母可缩短发酵时间12～22 h，从而大量减少发酵能耗，提升设备利用率，增加酒精收率。
　　2.2  酒母培养浓度优化和最佳工艺的确定
　　为了减少浓醪发酵过程中高渗透压对酒母扩培造成的影响，改善酒母形态，提高酒母质量，必须根据酵母生长的不同时期对糖耐量的不同特点进行培养，以确定最佳的扩培工艺。试验条件：将液化醪分别按照外观糖16～18oBx和11～13oBx两个范围进行稀释，然后接种干酵母，在28～30 ℃条件下培养8～12 h，通过对比不同液化醪浓度扩培条件下酵母生长形态、酵母出芽率、死亡率、产酒率等指标，最终确定酒母培养最佳工艺条件。酒母培养浓度优化和最佳工艺研究结果见图2。
　　由图2可以看出，在较低外观糖条件下，酵母形状从椭圆形转向圆形，形态较原来稍小，酵母健壮。而在高糖浓度下酵母形状出现拉长，数量相对较少，酵母生长明显受抑制。 　　2.3  糖化酶的筛选和最佳发酵效果的确定
　　浓醪发酵过程中如果单糖浓度较高，容易形成较高的渗透压，不利于酵母的生长繁殖，会抑制酒精发酵。因此，浓醪发酵除了要选用耐高渗透压酵母菌种外，还必须通过工艺控制来定量供糖，使发酵醪中的单糖浓度维持在较低的水平，以降低渗透压高对发酵造成的负面影响。
　　通过对比不同型号的诺维信糖化酶的发酵性能，最终筛选出性能优良的NWTU1糖化酶。该糖化酶在发酵初期糖化速度慢，醪液渗透压较低，有利于浓醪发酵初期酵母生长，发酵结束时酵母死亡率低，残糊精低，酒分较高。糖化酶的筛选和最佳发酵效果的确定结果见表1。从酒分来看，NWTU1组酒分比JNT01、GLT01组都高，酒分达到15.3%（v/v）;从总糖来看，NWTU1组酒分比JNT01、GLT01组都低，总糖达到1.30 g/100 mL。从关键指标可以看出，NWTU1组发酵效果优于JNT01、GLT01组。
　　2.4  最佳酵母接种量发酵的确定
　　木薯粉浓醪发酵过程糖浓度高，如果酵母接种量过低，较高的渗透压会影响酵母的生长繁殖，延长发酵周期;如果酵母接种量太高，会造成酵母“吃不飽”，处于饥饿状态，影响酵母的质量。因此，木薯粉浓醪发酵过程中必须保证合适的酵母接种量，既保证醪液中合适的糖分浓度，保证正常的发酵速度，又能保证酒母的质量。
　　不同接种量对发酵效果的影响见表2。由表2可以看出，浓醪发酵过程中酒母接种量为30%时，酒分/总糖比值最高，说明酒母接种量为30%时糖酒转化率最高。
　　2.5  最佳尿素添加量的确定
　　木薯原料中蛋白质含量较低，不能满足发酵过程中酵母生长的需要，因此必须通过外加氮源的方式来提高发酵醪中氮含量。
　　不同尿素添加量对发酵的影响见表3。由表3可以看出，当尿素添加量为2.45 kg/t木薯时，糖酒转化提高率最大。
　　2.6  适宜抑菌剂的确定
　　通过青霉素和抑菌剂A对比试验研究，筛选出抑菌效果比青霉素效果好的抑菌剂A，实验结果见表4。由表4可以看出，抑菌剂A能够有效地抑制酒母发酵醪中杂菌的生长，升酸差1.5，比青霉素低，满足生产的稳定运行要求。因此，抑菌剂A可以替代原来的青霉素作为发酵抑菌剂，解决长期使用单一抑菌剂会使杂菌耐药性增加而造成系统染菌的问题。
　　3  结 论
　　（1）对高性能酿酒酵母进行木薯浓醪同步糖化发酵验证试验，酵母在发酵48 h后酒分就超过了15.0 %，残糖含量也达到发酵结束指标。
　　（2）通过对新的同步糖化浓醪发酵工艺的研究，确定了最佳发酵条件为：接种量30%，氮源添加量为2.45 kg/t木薯。同时，筛选出NWTU1糖化酶和抑菌效果好的抑菌剂A，解决了浓醪同步糖化定量供糖的问题，浓醪发酵酒分达到15%以上。
　　（3）通过酒母培养工艺的研究，确定酒母培养的外观糖为11～13oBx，解决了浓醪发酵过程渗透压高不利于酵母生长、酒母质量差的问题。
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