酶解与超声波辅助提取白藜芦醇工艺优化及其含量的HPLC测定

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　　摘      要：建立超声波辅助酶法提取葡萄皮渣中白藜芦醇的有效工艺及其含量的HPLC测定方法，采用单因素实验和L9（34）正交试验确定从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的最佳工艺，并采用高效液相色谱法测定其白藜芦醇含量。结果表明：酶解与超声波辅助提取白藜芦醇的最佳工艺条件为酶解温度55 ℃，超声波处理时间30 min，料液比为1∶35，提取时间为4 h，提取温度75 ℃。提取物的白藜芦醇平均含量为0.968 5±0.025 mg/g。优选的制备工艺可行、稳定，检测方法快速、简便，适用于葡萄皮渣中白藜芦醇的提取和分析。
　　关  键  词：白藜芦醇;超声波;葡萄皮渣;提取工艺
　　中图分类号：R284       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）05-0846-05
　　Abstract： An effective extraction process of resveratrol by ultrasonic assisted enzymatic method was established as well as the determination method of the content by HPLC. The extraction process of resveratrol from grape pomace was optimized by single factor experiment and L9（34） orthogonal design test. The content of resveratrol was determined by HPLC. The results showed that optimal extraction process was as follow： the temperature of enzymatic hydrolysis 55 ℃， the time of ultrasonic treatment 6 min， the ratio of material to liquid 1∶35， the time of extraction 4 h， and the temperature of extraction 75 ℃.The average resveratrol content of extract was 0.968 5±0.025 mg/g. The optimum preparation process was suitable for the extraction of resveratrol from grape pomace，which was feasible and stable. The rapid and simple concentration test method was also suitable for quantitative analysis of resveratrol in grape pomace.
　　Key words： Resveratrol; Ultrasound extraction; Grape skin residue; Extracting process
　　最近几年以来，白藜芦醇因其多种多样的活性及特点，开始在国内临床中通过实验提取，并在各个相关领域当中广泛应用[1]。因此，研究提取白藜芦醇的有效方法具有十分重要的临床及社会意
　　义[2]。我国具有十分丰富的葡萄资源，绝大部分都应用在酿酒当中，而酿酒所剩下的大量葡萄皮渣则被当作饲料应用[3-4]。目前，提取白藜芦醇的主要方法有酶法、超临界萃取法、超声波法、热水浸提法及有机溶剂法等[5]。但两种及两种以上方法联用进行提取的报道较少。酶法当中的纤维素酶可以使纤维发生水解，使植物的细胞壁受到损坏，将细胞当中的内容物充分地释放出来，更利于提取相关有效成分[6-7]。超声波法[8]通过超声波的破碎作用来充分溶出相关生物活性的物质。因此，本文拟通过超声波辅助酶法从葡萄皮渣中提取白藜芦醇，采用单因素分析和正交实验，以其提取效果为基础建立最优的提取工艺，同时采用高效液相色谱法（HPLC）测定所提取白藜芦醇的含量。本实验的目的在于建立有效的从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的工艺并测定其含量，有效拓展葡萄皮渣的应用，从中获得良好的经济效益。
　　1  实验部分
　　1.1  实验仪器
　　Agilent 1220高效液相色谱仪（美国安捷伦）;色谱柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5 μm） ;FA1224S电子天平（德国赛多利斯）;超纯水纯化系统（南京易普易达）;超声清洗器（昆山超声）;旋转蒸发仪（上海爱朗仪器）;超声波萃取仪（宁波新芝生物）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
　　1.2  实验材料及试剂
　　葡萄皮渣（由购自大润发超市的葡萄制得）：葡萄取皮，将葡萄皮干燥粉碎后，使用60目筛进行过筛;纤维素酶（酶活力：500 000 U/g，浙江一诺生物科技有限公司）;白藜芦醇标准品（sigma公司）;甲醇、无水乙醇、冰醋酸：购自广州西陇化工有限公司，均为分析纯;超纯水为实验室自制所得。
　　1.3  實验方法
　　1.3.1  白藜芦醇提取物制备
　　（1）白藜芦醇提取物制备流程
　　称取1 g葡萄皮粉于100 mL锥形瓶，加入适量纤维素酶及水进行酶解。pH = 5，酶解时间 1.5 h，酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，将超声波的功率设置为400 W，超声波处理30 min，超声波处理后于75 ℃提取4 h。采用6 000 r/min离心提取液15 min，取上层清液减压蒸馏，得白藜芦醇提取物。 　　（2）白藜芦醇制备工艺筛选
　　应用单因素优选法，分别筛选出酶解温度、超声波处理时间、料液比、提取时间、提取温度。
　　酶解温度：取粉末适量，添加1.5 mg/g的纤维素酶，pH = 5，酶解时间 1.5 h，设置酶解温度分别为45、50、55、60、65 ℃，而后按照制备流程提取白藜芦醇。
　　超声波处理时间：超声波功率设置为400 W，处理时间分别设置为10、20、30、40、50 min，按制备流程进行提取。
　　料液比：设置料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶49，按制备流程进行提取。
　　提取时间：设置提取时间为2.5、3、3.5、4、4.5 h，按制备流程进行提取。
　　提取温度：设置提取温度为60、65、70、75、80 ℃，按制备流程进行提取。
　　根据提取所得白藜芦醇含量筛选出适宜的酶解温度、超声波处理时间、料液比、提取时间及提取温度。单因素实验中，白藜芦醇含量测定采用紫外分光光度法，Y=0.694 2X-0.031 5，R 2=0.994 2，线性范围为3.95 ～ 17.71 μg/mL。
　　（3）提取工艺优化
　　采用L9 （ 34 ） 表进行正交试验，因素水平见表 1，评价指标为提取物中白藜芦醇的含量，以此优化从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的工艺。
　　（4）不同提取方法的比较
　　为进一步考察超声波对从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的效果，在上述实验的基础上，采用4种不同的提取方法，比较其所提取的白藜芦醇含量。
　　方法1：称取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。
　　方法2：称取葡萄皮粉，加入纤维素酶及水适量进行酶解。pH=5，酶解时间1.5 h，酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。
　　方法3：称取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，超声波的功率400 W，超声波处理30 min，超声波处理后于75 ℃提取4 h。
　　方法4：称取葡萄皮粉，加入纤维素酶及水适量进行酶解。pH=5，酶解时间1.5 h，酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，超声波功率400 W，超声波处理30 min，超声波处理后于75 ℃提取4 h。
　　1.3.2  白藜芦醇含量的HPLC测定
　　（1）色谱条件
　　色谱柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5μm）;流动相为1%甲醇-1%冰醋酸（35∶65）;进样量为20 μL;流速为1.0 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为305 nm。
　　（2）工作曲线的建立
　　对照品溶液的制备：精密称取白藜芦醇标准品，用甲醇配制成浓度为5.000 mg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液，分别制成浓度为0.002 5、0.005、0.012 5、0.025 0、0.050 mg/mL的对照品溶液。
　　按1.3.2项下色谱条件进样测定，记录相应色谱峰峰面积，以对照品质量（μg）为横坐标，相应峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=9 154.7X+13.514，r=0.987 5，白藜芦醇含量在26 ～ 5 320 μg范围内线性关系良好。
　　（3）精密度试验
　　 取上述浓度为0.012 5 mg/mL的对照品溶液，按照1.3.2项下色谱条件连续进样5次，记录相应色谱峰峰面积，计算白藜芦醇峰面积的RSD。
　　（4）稳定性试验
　　取白藜芦醇提取物溶液，并用微孔滤膜过滤（孔径0.45 μm），分别于制备后0、1、2、4、6、8 h在1.3.2项色谱条件下进行测定，记录相应色谱峰峰面积，计算样品白藜芦醇峰面积的RSD。
　　（5）重复性试验
　　取白藜芦醇提取物，制备成6份样品溶液，按1.3.2项下色谱条件进行测定，记录相应色谱峰峰面积，计算样品中白藜芦醇的平均含量及其RSD。
　　（6）加样回收实验
　　 取同一批次制备的白藜芦醇提取物，制备成相应的6份溶液，每份精密加入对照品贮备液0.1 mL，微孔滤膜过滤（孔径0.45 μm），按1.3.2项下色谱条件进行测定，记录相应色谱峰峰面积，计算平均回收率及其RSD。
　　（7）样品含量测定
　　 取不同批次制备的白藜芦醇提取物适量，制备成相应的溶液，按1.3.2项下色谱条件进行测定，每批次样品平行测定两次，记录相应色谱峰峰面积，计算样品含量。
　　2  结果与讨论
　　2.1  白藜芦醇制备工艺筛选
　　 白藜芦醇制备工艺筛选结果见表2。酶解温度对纤维素酶的酶活性和酶促反应速度有很大的影响。
　　从表2中可以得知，酶解温度在55 ℃时，白藜芦醇的提取含量最高，为0.79 mg/g，大于55 ℃之后，提取含量逐渐降低。 超声波处理时间在30 min时，白藜芦醇的提取含量为0.78 mg/g，为最大值。料液比为1∶40时，白藜芦醇的提取含量最高，但料液比1∶30和1∶35的提取含量与1∶40所得的提取含量相差不大。提取时间为4 h时，白藜芦醇的提取含量为0.78 mg/g，提取时间延长，提取含量反而降低。提取温度为75 ℃时，白藜蘆醇的提取含量最高，为0.81 mg/g。通过单因素优选法，初步确定酶解温度为55 ℃，超声波处理时间为30 min，料液比为1∶35，提取时间为4 h，提取温度为75 ℃。
　　2.2  提取工艺的正交优化
　　在单因素实验的基础上，选取酶解温度（A）、超声波处理时间（B）、料液比（C）、提取时间（D）作为考察因素进行正交优化实验，以白藜芦醇含量为评价指标，结果见表3。通过表3和表4可知，影响提取工艺的因素依次为料液比、提取时间、超声处理时间及酶解温度。 　　料液比对从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的影响最为显著，其次是提取时间，超声处理时间及酶解温度对提取工艺的影响不明显。通过正交实验优化，从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的最佳工艺组合为A1B2C2D2，综合单因素实验，最后确定提取最佳工艺为酶解温度55 ℃，超声波处理时间30 min，料液比为1∶35，提取时间为4 h，提取温度75 ℃。为验证工艺的可行性和稳定性，在上述条件下，重复3次实验，提取制备了3份白藜芦醇提取物，其白藜芦醇含量平均值为1.018 mg/g，RSD为1.19%。
　　2.3  不同提取方法的比较
　　 不同提取方法提取葡萄皮渣中白藜芦醇的结果见表5。
　　从表5可知，加入纤维素酶及采用超声波辅助均可提高白藜芦醇的提取含量，超声波辅助的提取增量作用大于加入纤维素酶，而两种共同作用可以更为有效地提高提取含量。实验结果说明超声波对从葡萄皮渣中提取白藜芦醇是有效的。
　　2.4  白藜芦醇含量的HPLC测定
　　2.4.1  精密度实验
　　精密度实验结果见表6，白藜芦醇峰面积的RSD为0.92%（n=5），表明仪器精密度良好。
　　2.4.2  稳定性实验
　　稳定性实验结果见表7，白藜芦醇峰面积的RSD为0.87%（n=6），表明样品溶液在8 h内稳定性良好。
　　2.4.3  重复性实验
　　重复性实验结果见表8，白藜芦醇峰面积的RSD为0.64%（n=6），表明该方法重复性良好。
　　2.4.4  加样回收实验
　　通过峰面积的测定，计算得白藜芦醇平均加样回收率为98.08%，RSD为1.82%（n=6）。
　　2.4.5  样品含量测定
　　 实际样品含量测定结果见表9。
　　3  结 论
　　白藜芦醇在自然植物中广泛存在，同时具有很高的食药两用价值 [9-10]。但从葡萄皮渣中提取白藜芦醇进行再利用的研究较少。因此，研究建立了超声波辅助酶法 [11]提取葡萄皮渣中的白藜芦醇，并采用HPLC[12]对提取物中的白藜芦醇含量进行测定，提高了检测方法的效率和灵敏度同时进行了质量控制。通过单因素实验、正交实验研究后，确定了从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的最佳工艺为：酶解时间1.5 h，酶解温度55 ℃，酶解后按料液比为1∶35，超声波处理时间30 min，超声波处理后于75 ℃提取4 h。该工艺条件下提取所得提取物的白藜芦醇含量为0.968 5±0.025 mg/g（n=8）。综上所述，在葡萄皮渣中提取白藜芦醇时，应用超声波辅助酶法复合处理的方法可以更加显著地提高白藜芦醇的提取含量，同时采用HPLC检测含量进行质量控制，该工艺稳定性高，可操作性强，灵敏度高，有效拓展了葡萄皮渣的应用。
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