全蝎中多糖提取分离及其药理作用研究

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　　摘      要：在已有的全蝎酶解產物研究基础上，分离全蝎中的蛋白，提纯多糖，并研究全蝎中除去蛋白与未除蛋白多糖的抗炎作用。方法：用胰蛋白酶制备全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制备低纯多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白质，测定全蝎中多糖的质量分数并进行抗炎研究。结论：未除蛋白组的多糖质量分数为42.12%，除去蛋白的多糖质量分数为87.27%，全蝎中多糖可抑制RAW264.7炎症反应，多糖蛋白对细胞炎症抑制作用不明显，除去蛋白后全蝎多糖对IL-6炎症因子的抑制效果不显著，对TNF-α炎症因子抑制效果显著，随药液浓度不断增大，抑制效果先上升后下降，当质量浓度为1.5 mg·mL-1时，药液中TNF-α炎症因子质量浓度最低，说明该质量浓度下全蝎多糖的抗炎效果最为显著，减少了炎症因子的分泌，具有重要研究价值和市场前景。
　　关  键  词：全蝎;多糖;除蛋白;抗炎
　　中图分类号：TQ 028        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）06-1023-04
　　Extraction and Separation of Polysaccharides from Scorpio and Their Pharmacological Effects
　　SONG Xing-shuang， LI Jia-yi， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， ZHANG Shan-shan， WANG Ji-hui
　　（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）
　　Abstract： On the basis of existing research on scorpion enzymatic hydrolysate， protein in Scorpio was separated， polysaccharide was purified， and anti-inflammatory effects of protein removed and non-protein removed polysaccharide in Scorpio were studied. Methods： Scorpio enzymolysis liquid was prepared by trypsin， crude polysaccharide was precipitated by ethanol， low pure polysaccharide was prepared， protein in polysaccharide was removed by sevag method， content of polysaccharide in Scorpio was determined and anti-inflammatory study was carried out. Conclusion： The polysaccharide content of the non-deproteinized group is 42.12%， the polysaccharide content of deproteinized group is 87.27%， the polysaccharide in Scorpio can inhibit RAW264.7 inflammatory reaction， the inhibitory effect of polysaccharide protein on cellular inflammation is not obvious， the inhibitory effect of Scorpio polysaccharide on IL-6 inflammatory factor after deproteinization is not significant， the inhibitory effect on TNF-α inflammatory factor is significant， with the increasing concentration of liquid medicine， the inhibitory effect first rises and then falls. When the concentration is 1.5 mg mL-1， the concentration of TNF-α inflammatory factor in the liquid medicine is the lowest， which indicates that Scorpio polysaccharide has the most significant anti-inflammatory effect at this concentration， reduces the secretion of inflammatory factor， and has important research value and market prospect.
　　Key words： Whole scorpion; glycoamine polysaccharides; deproteination; Anti-inflammatory
　　中药全蝎始载于《蜀本草》，味辛，性平，有毒，为祛风攻毒常用药，可用于治疗痉挛抽搐、风湿、癫痫等疾病[1]，具有很好的治疗效果。多糖主要存在于动物类药物中，由氨基糖和糖醛酸组成[2]，在免疫调节、肿瘤治疗、炎症反应等方面具有一定的治疗作用[3]。 　　在生物体中，多糖与蛋白质的结合状态易被水解破坏，因此本实验采用sevag法和水提醇沉法除去糖蛋白中的蛋白质，测定全蝎中多糖的含量并进行体外抗炎实验。
　　在进行Sevag法、水提醇沉法之前都将对药物进行酶解。Sevag法对有机试剂用量大，但其适用范围广，可用于多种多糖提取时的蛋白分离。
　　1  材料
　　1.1  样品
　　全蝎冻干粉（实验室自制）。
　　1.2  试剂
　　胰蛋白酶、氯仿、苯酚、无水乙醇等所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水，细胞炎症试剂盒（晶美生物工程有限公司）。
　　1.3  仪器
　　HH-6 数显恒温水浴锅;KQ-500E 型超声波清洗器;SHB-III循环水式真空泵;ST 16R 高速冷冻离心机;FA 1004N 电子天平;UV9100B型紫外可見分光光度计。
　　2  步骤
　　2.1  全蝎多糖标准曲线
　　称取0.1 g恒重无水葡萄糖，溶解定容为
　　1 mg·mL-1，配制不同质量浓度溶液，各加入1 mL 5%的苯酚[4]，混匀，加入5 mL浓硫酸[5]，摇匀过程中小心溅出烫伤，放入90 ℃的水浴锅中静置20 min，放冷，测定待测溶液中490 nm波长下[6]多糖的吸光度。
　　2.2  制备全蝎酶解液
　　通过前期查阅文献已经确定制备全蝎酶解液的最佳工艺流程：料液比为1∶40 g·mL-1[7]，酶解温度40 ℃，酶解时间3 h，最适pH=8.5，胰蛋白酶为    2 000 u，离心抽滤，冷藏保存。
　　2.3  醇沉提取多糖蛋白
　　在酶解液中加入无水乙醇调至溶液的质量分数为80%[8]，以3 000 r·min-1离心10 min，可分离出多糖蛋白，取上清液重复上述步骤，直至没有沉淀析出为止[9]，分离沉淀，冻干，得到全蝎多糖蛋白。
　　2.4  Sevag法除蛋白提取多糖
　　料液比1∶40 g·mL-1，40 ℃下进行超声20 min，加入胰蛋白酶酶解。调pH为7.5，40 ℃下恒温酶解3 h，酶解后置于100 ℃水浴锅内10 min煮沸灭酶，离心去除杂质。移液枪移取40 mL氯仿加入10 mL正丁醇中制得 Sevag试剂[10]。取5 mL粗提液置于试管中，加入1 mL Sevag试剂，振摇30 min，静置12 h后离心，旋蒸浓缩，加入适量80%无水乙醇，沉淀12 h，离心10 min，将沉淀分离冻干，计算全蝎中除去蛋白后多糖得率。
　　2.5  抗炎实验
　　2.5.1  细胞培养
　　取出冰冻保存的RAW264.7细胞，加入DMEM高糖培养基，细胞长满板底后进行消化换液，收集细胞悬液，放入5% CO2培养箱中37 ℃恒温培养[11]，放入离心机中以1 000 r·min-1离心3 min后，倾出上清液，重复上述步骤，进行传代培养[12]。
　　2.5.2  细胞因子含量测定
　　将细胞放入培养箱中培养，细胞长满后，吸出培养液，加入2 μg·mL-1 LPS 500 μL，用移液枪分别取500 μL的质量浓度为4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mg·mL-1的全蝎多糖蛋白液与全蝎多糖液，每组设置一个LPS组与空白组，24 h后，收集上清液[13]，进行炎症因子TNF-α和IL-6的质量浓度测定[14]。
　　2.5.3  数据分析
　　采用spss软件对结果进行分析。
　　3  结果
　　3.1  多糖标曲
　　如图1所示，标准曲线方程为y = 2.045x- 0.004 8，R2=0.999 6，结果表明多糖质量浓度不同会引起吸光度不同。
　　3.2  除蛋白前后多糖质量分数测定
　　如表1所示，将吸光度值代入线性方程中计算醇沉全蝎酶解液提取蛋白多糖所得糖蛋白质量分数分别为42.56、41.17、42.64 mg·g-1，平均得率为42.12%。
　　如表2所示，全蝎中的蛋白质除去后所测多糖含量为87.43、87.02、87.36 mg·g-1，平均得率为87.27%，相比于未除蛋白以多糖蛋白形式存在时得率差异较大，全蝎提取多糖得率明显提高。
　　3.3  体外抗炎实验
　　体外抗炎实验中，组别编号1-7分别对应正常细胞组，炎症诱导组及质量浓度为2.00、1.50、1.11、0.50及0.25 mg·mL-1全蝎多糖蛋白，结果表明，全蝎多糖蛋白5组不同浓度的剂量组的细胞IL-6、TNF-α炎症因子水平均高于正常细胞组和炎症诱导组[15]，见表3，就整体而言没有明显作用趋势，如图2所示，经多次重复实验，排除实验误差的影响，多糖蛋白对细胞炎症有抑制作用不明显，可能原因为蛋白质与多糖结合阻碍了全蝎多糖中有效成分发挥作用，不仅未起到抑制作用反而会诱导炎症作用。 　　如图3、表4所示，全蝎中除去蛋白质后多糖的抗炎效果显著高于未除蛋白之前。与未除蛋白质之前相同，全蝎多糖除蛋白后5组不同质量浓度的剂量组的IL-6炎症因子水平均高于正常细胞组和炎症诱导组。全蝎多糖对IL-6炎症因子的抑制效果不显著，对TNF-α炎症因子抑制效果显著，随药液质量浓度不断增大，抑制效果先上升后下降[16]，当质量浓度为1.5 mg·mL-1时，药液中TNF-α炎症因子质量浓度最低，随着质量浓度的降低，炎症发生反而增强，说明该浓度下全蝎多糖的抗炎效果最为显著，临床效果最佳。
　　4  结束语
　　细胞炎症为人体常见疾病之一[17]，并能间接引发肿瘤等疾病。小鼠白细胞介素IL-6、肿瘤坏死因子等炎症因子则为直接诱导因素[18]，导致人体调节紊乱、白细胞增多、局部组织病变等[19]。一般情况下出现炎症多为人体的自我防御机制，通过炎症反应进而引起人们警惕。炎症反应可由肿瘤坏死因子、内毒素等影响因子引起，许多中药在治疗临床炎癥不良反应方面可发挥重要作用。
　　全蝎具有软坚散结、搜风通络、祛风逐瘀的疗效，常与蜈蚣结合成药对使用[20]，周青[21]等通过药理实验证明从全蝎蝎尾中提取的蝎毒对于肺癌、胃癌、前列腺肿瘤具有一定的抑制作用;代龙[22]通过制备全蝎酶解液发现全蝎具有较好的抗凝血作用;梁益[23]等以海马作为慢性癫痫模型证明乙醇提取全蝎中的有效物质可有效减少癫痫的发生，降低患病风险。
　　目前关于全蝎的研究较多，但将全蝎中多糖蛋白分离测定除蛋白后的多糖含量较少[24]，本实验采用胰蛋白酶制备全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制备低纯多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白质，测定全蝎中多糖的质量浓度并进行抗炎研究。体外抗炎实验表明，若未除蛋白，全蝎多糖蛋白抑制效果整体作用趋势不明显;除去蛋白后，全蝎多糖对IL-6炎症因子的抑制效果不显著，对TNF-α炎症因子抑制效果显著，随药液质量浓度不断增大，抑制效果先上升后下降，当质量浓度为1.5 mg·mL-1时，药液中TNF-α炎症因子质量浓度最低，说明该质量浓度下全蝎多糖的抗炎效果最为显著，炎症因子最少，结果表明全蝎具有一定的抗炎作用，可用于新药物研发。
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