微生态制剂对凡纳滨对虾生长·酶活及养殖水质的影响

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　　摘要为了研究3种微生态制剂不同的组合方案对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长性能、酶活力和抗氧化能力的影响，根据正交试验设计，在饲料中添加不同比例的微生态制剂，确定3因素添加量的最优组合：LK（干酪乳杆菌）107 CFU/mL、NJ（侧孢芽孢杆菌）106 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢杆菌）107 CFU/mL。通过向养殖水体定期泼洒不同组合方案的微生态制剂，确定了3种微生态制剂添加量的最优组合为：LK（干酪乳杆菌）107 CFU/mL、NJ（侧孢芽孢杆菌）107 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢杆菌）106 CFU/mL。将最优组合微生态制剂全池定期泼洒与普通对虾养殖池的水体水质及对虾养殖情况进行对比，结果表明微生态制剂对养殖水体水质COD平均降解率为8%，氨氮平均降解率24.4%，亚硝酸盐氮平均降解率31.1%，总氮平均降解率30.1%，总磷平均降解率9.8%，养殖收益较对照组提高了18.7%。
　　关键词凡纳滨对虾;微生态制剂;生长性能;消化酶活力;抗氧化酶活力;水质净化
　　中图分类号S968.22文献标识码A文章编号0517-6611（2020）15-0096-06
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.027
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effects of Probiotics Preparation on the Growth， Enzyme Activities，Aquatic Water of Litopenaeus vannamei
　　LIU Yihan， LIN Lingyun， YIN Wenlin et al
　　（Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries， Huzhou，Zhejiang  313001）
　　AbstractIn order to study the effects of different combinations of three kinds of probiotics preparation on the growth， enzyme activities and antioxidant capacity of Litopenaeus vannamei， different proportions of three kinds of probiotics preparation were added in the feed according to orthogonal test design. The optimal combination added in the feed was LK （Lactobacillus casei） 107 CFU/mL， NJ （Bacillus laterosporus） 106 CFU/mLand JXCB-2 （Bacillus licheniformis） 107 CFU/mL. Different proportions of three kinds of probiotics preparation were regularly splashed in the culture water body， and the optimal combination added in the culture water was LK 107 CFU/mL， NJ 107 CFU/mL， JXCB-2 106 CFU/mL. In addition， the optimal combination of probiotics was regularly splashed in the culture pond， which was compared with the water quality and shrimp culture in the control pond. The results showed that average COD degradation rate of culture water body was 8%， the ammonia nitrogen decreased by 24.4%， the nitrite nitrogen decreased by 31.1%， the total nitrogen decreased by 30.1%， the total phosphorus decreased by 9.8%， and the economic income of shrimp culture increased by 18.7% compared with control group.
　　Key wordsLitopenaeus vannamei;Probiotics preparation;Growth performance;Digestive enzyme activity;Antioxidant enzyme activity;Water purification
　　基金項目“十二五”农村领域国家科技支撑计划课题（2015BAD13B04）。
　　作者简介刘忆瀚（1993—），男，浙江湖州人，研究实习员，从事水产保护学研究。*通信作者，研究员，硕士，硕士生导师，从事水产病害防控研究。
　　收稿日期2019-10-23;修回日期2019-11-29
　　凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）自1988年引入我国以来，凭借其生长速度快、营养要求低、出肉率较高、抗逆性较强等优点，成为我国养殖面积最广、养殖产量最高的对虾种类[1]。近些年，在市场利益的带动下，高产量高收益的凡纳滨对虾发展迅速，养殖户的热情也很高，但由于水质变差以及虾病害的暴发，导致许多养虾人损失惨重。虽然目前抗生素等药品能对对虾的部分疾病产生作用[2]，但病原也会相应的产生抗药性[3]，从而导致药性的降低，并且药物的残留会污染养殖水体，打破水体中有益微生物平衡，对对虾产生二次污染[4]。微生态制剂的使用不仅可以稳定养殖水体，减少病害的暴发[5]，而且可以促进对虾的生长[6-7]，提高对虾机体的免疫力并且提高养殖产量和效益。 　　微生态制剂因其副作用小、无残留、成本低、效果显著、不污染环境等特点，使其在凡纳滨对虾养殖中应用越来越受到养殖户的关注。目前研究较多的是芽孢杆菌、乳酸菌类等。尤其是芽孢杆菌属（Bacillus）自身可以产生大量的胞外酶，在对虾中使用可以增加其肠道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的活力，提高对虾对饲料的消化率[8]。Ziaei-Nejad等[9]评价了芽孢杆菌属的几种常见有益菌对对虾生长、存活及消化酶活力的影响，表明芽孢杆菌产生的胞外酶类物质能有效将脂类、蛋白质及碳水化合物等有益成分降解成小分子物质。乳酸菌可以分泌多种有益物质，对对虾本身起到多种功效，如修复对虾肠道损伤、提高对虾的非特异免疫机能、改善对虾饲料的消化吸收等，因此乳酸菌能应用在对虾的养殖过程中，对对虾的健康生长起到促进作用，进而可以提高对虾自身的抗病能力。王国霞等[10]在凡纳滨对虾饲料中添加了液体嗜酸乳杆菌（L.acidophilus），结果表明在对虾饲料中添加10%的乳酸菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾的生长性能和消化酶活性，改善其非特异性免疫力。乳酸菌在对虾病害防控上的作用值得肯定，但需要通过后喷涂、拌料、筛选耐高温菌株等方式解决乳酸菌抗逆性差的问题[11]。
　　笔者在结合现有资料的基础上，将干酪乳杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌3株土著微生物分别制备成发酵液，并按一定比例拌入对虾饲料中，探究其对凡纳滨对虾生长性能、酶活力及抗氧化能力的影响;同时，选取微生态制剂为研究对象，将其泼洒入凡纳滨对虾养殖水体中，评估其对水质的净化效果以及对养殖收益的影响，旨在为微生态制剂在凡纳滨对虾养殖过程中的添加和使用提供科学依据。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　试验用虾：凡纳滨对虾购自绍兴市上虞区明诚农业养殖开发有限公司对虾养殖示范区，体质量（5.0±0.5）g，体质健壮。虾苗购自正大集团中正苗，体长为（0.60±0.05）cm。投喂的饲料统一购自浙江海大饲料有限公司的对虾配合饲料，蛋白质含量为43%，不含微生态制剂成分。
　　微生态制剂：3株土著微生物LK（干酪乳杆菌）、NJ（侧孢芽孢杆菌）、JXCB-2（地衣芽孢杆菌）由笔者所在实验室2017年从凡纳滨对虾养殖池塘中分离纯化所得。3种微生物活菌量分别达到5.43×109、7.36×109、5.10×109 CFU/mL。
　　养殖池塘：选取绍兴市上虞区明诚农业养殖开发有限公司养殖示范区2个规格相同的养殖池塘作为监测对象。每个养殖池塘面积0.53 hm2，水深2 m，配套独立的排污进水系统，水面及水底增氧充足，整体养殖条件较完善。
　　1.2试验方法
　　1.2.1内服微生态制剂的研究。
　　采用3因素3水平正交试验设计。根据L 9（34）正交设计表（表1）配制9种试验颗粒饲料。试验的颗粒饲料是在对虾配合饲料中，按终浓度为0、106、107 CFU/mL 3个水平的比例拌入微生物制剂发酵液，充分混匀吸收，在室内晾干制成干颗粒饲料。具体操作方法是将微生态发酵液用喷壶均匀的喷洒在颗粒饲料的表面，晾干后制成干颗粒饲料，基本不会影响颗粒饲料的耐水性，保证饲料投喂过程中不松散。
　　取規格均匀、体质健壮的810尾对虾分别放入100 cm×80 cm×65 cm的塑料桶进行试验，桶内水体体积400 L，共分为9组，每组设置3个重复，每个重复30尾。试验期间，水温24～30 ℃，盐度2.5‰～3.5‰，pH 8.5～9.0，连续充气。每天投喂3次（06：30、12：30、18：30），投饲量约占虾体重的5%，持续投喂至试验结束。试验持续28 d。在试验期间，于28 d投饲结束后停食24 h采集肝胰腺、肠道和血液，血液4 ℃下静置4 h，以4 000 r/min离心10 min，取上清液-20 ℃下保存。剔除脂肪组织后的肝胰腺和肠道，用4 ℃的去离子水冲洗，然后用滤纸吸干水分，-20 ℃下保存备用。试验结束后，测量各组凡纳滨对虾酶活力、抗氧化能力、存活率及增重率。测定时，将保存的肝胰腺和肠道解冻，以1∶9的质量体积比在冰浴下匀浆，2 500 r/min 4 ℃下离心10 min，取上清液-20 ℃下保存，6 h内检测完成。
　　1.2.2外用微生态制剂的研究。
　　1.2.2.1
　　微生态制剂优化试验。试验在绍兴市明诚农业有限公司养殖场进行。试验塑料桶规格为100 cm×80 cm×65 cm，桶内水体体积400 L，放置于养殖场透光塑料大棚下，按表1中分组共分为9个组，每个组3个重复，每个重复30尾。凡纳滨对虾取自公司内养殖池塘，规格为（5.0±0.5）g/尾，每天按对虾体重的5%投饲，分3次投喂。试验前分别测量各组水质指标，试验开始时每隔7 d按表1所列组合在各组中泼洒微生态制剂1次，试验持续28 d。试验结束时测量水质指标，得出微生态制剂泼洒时的最优组合。试验期间保持桶底吸污，持续充气增氧，不大量换水、少量补水以补充自然蒸发的水量。
　　1.2.2.2
　　池塘养殖试验。试验按照表2进行，分微生态制剂组及对照组，其中微生态制剂组养殖过程中全池每周一次泼洒最优组合的微生态制剂，对照组按养殖场常规管理水质方法进行操作。
　　每隔7 d随机取100 mL养殖池塘的水样，抽滤后进行氨氮、亚硝酸盐氮、总氮、总磷、COD等水质指标的测定。养殖3个月结束时，记录各组凡纳滨对虾总产量及平均规格计算各组的总产值，并根据成本计算各组的利润及产出比。
　　1.3水质的测定
　　氨氮的含量测定采用纳氏试剂法，亚硝酸氮含量测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法，盐度使用盐度计测定，温度、pH使用美国哈希HACH水质分析仪，型号HQ30d单路输入多参数数字化分析仪。总氮、总磷、COD使用美国哈希HACH试剂盒及美国哈希HACH分光光度计DR2000测定。 　　1.4相关酶活性的测定
　　对各处理组凡纳滨对虾进行蛋白酶（protease）、脂肪酶（lipase）、淀粉酶（amylase）、纤维素酶（cellulase）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、酚氧化酶（phenol oxidase，PO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、碱性磷酸酶（alkaline  phosphatase，AKP）活力的测定，均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体操作过程参照试剂盒说明书进行。
　　1.5数据统计与分析
　　数据和图表使用Excel软件处理，方差分析及显著性差异比较采用SPSS 22.0统计软件处理，P<005表示差异显著，结果均以平均值±标准误表示。
　　安徽农业科学2020年
　　2结果与分析
　　2.1内服微生态制剂对凡纳滨对虾生长的影响
　　2.1.1微生态制剂对凡纳滨对虾生长性能的影响。
　　由表3可知，试验开始时，各组应有凡纳滨对虾90尾，平均体质量均控制在（5.0±0.5）g/尾。28 d试验结束时，对照组存活率75.6%，其余组成活率均显著高于对照组（P<0.05）。对照组最终平均体质量7.67 g/尾，增重率53.3%，第2、4、6、7、9组增重率显著高于对照组（P<0.05）。试验组摄食率和饵料系数均显著高于对照组（P<0.05）。
　　2.1.2微生态制剂对凡纳滨对虾消化酶活力的影响。
　　由表4可知，各组蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶活力差异不显著（P>0.05）。其中107 CFU/mL LK组蛋白酶和淀粉酶活力最高，极差为12.88和1.61;106 CFU/mL LK组脂肪酶和纤维素酶活力最高，极差为3.21和0.23。106 CFU/mL的NJ组蛋白酶和淀粉酶活力最高，极差为32.5和1.28;107 CFU/mL NJ组脂肪酶和纤维素酶活力最高，极差为5.04和0.27。107 CFU/mLJXCB-2组蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力最高，极差分别为8.82、3.07和1.34 CFU/mL;0  CFU/mL JXCB-2组纤维素酶活力最高，极差为0.33。
　　2.1.3微生态制剂对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响。
　　由表5可知，各组SOD、PO、POD、AKP活力差异不显著（P>005）。其中，107  CFU/mL LK组SOD、PO、POD、AKP活力最高，极差分别为1.40、0.04、0.04和0.06。107   CFU/mL的NJ组SOD和AKP活力最高，极差为0.94和0.01;106   CFU/mL NJ组POD活力最高，极差为0.03;0   CFU/mL NJ组PO活力最高，极差为0.03。106   CFU/mL JXCB-2组SOD活力最高，极差为1.46;各水平JXCB-2组PO、POD、AKP活力无显著差异，极差为0、0.01和0.02。
　　综合3因素不同水平的作用以及考虑到生产成本，认为添加量的最优组合：LK 107 CFU/mL、NJ 106 CFU/mL、JXCB-2 107 CFU/mL。
　　2.2外用微生态制剂对养殖水体的影响
　　2.2.1优化微生态制剂组合。
　　由表6可知，第3、5、6、7、8、9组COD含量显著低于对照组（P<0.05），第2、4、6、7、9组氨氮含量显著低于对照组（P<0.05），第4、7、9组亚硝酸盐氮含
　　量顯著低于对照组（P<0.05），第2、3、4、6、7、8、9组总氮含量显著低于对照组（P<0.05），第5、6、7、9组总磷含量显著低于对照组（P<0.05）。其中，107 CFU/mL的LK组COD、氨氮、亚硝酸盐氮、总氮、总磷含量最低，极差分别为11.33、0.09、0003、1.16和0.25。107 CFU/mL的NJ组COD、氨氮、亚硝酸盐氮、总氮、总磷含量最低，极差分别为5.67、0.12、0.003、1.30和0.04。107 CFU/mL的JXCB-2组COD含量最低，极差为0.67;106 CFU/mL的JXCB-2组氨氮、亚硝酸盐氮、总氮、总磷含量最低，极差为0.18、0.005、1.07和0.07。
　　综合3因素不同水平的作用以及考虑到生产成本，认为添加量的最优组合：LK（干酪乳杆菌）107 CFU/mL、NJ（侧孢芽孢杆菌）107 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢杆菌）106 CFU/mL。
　　2.2.2微生态制剂对池塘养殖水体水质的影响。
　　通过全池每周一次定期泼洒“2.2.1”中最优组合微生态制剂，观察微生态制剂对池塘养殖水体水质的影响。从图1～5可知，在养殖期间微生态制剂组各水质指标总体上呈下降趋势，其中COD平均降解率为8%，氨氮平均降解率24.4%，亚硝酸盐氮平均降解率31.1%，总氮平均降解率30.1%，总磷平均降解率9.8%。由此可见，微生态制剂对养殖水体有明显的净化作用。
　　2.2.3养殖收益分析。
　　由表7可知，经过3个月的养殖，微生态制剂组成品虾规格要略高于对照组，且产量较高，由此带来的养殖收益较对照组提高了18.7%。
　　3讨论
　　3.1微生态制剂对凡纳滨对虾生长及消化酶活力的影响
　　陈晓瑛等[12]认为在凡纳滨对虾日粮中添加芽孢杆菌能够提高对虾机体肠道内消化酶活性的主要原因是芽孢杆菌进入机体肠道后能够产生大量的胞外酶，如淀粉酶和蛋白酶等，增加了肠道内消化酶的数量，2种不同来源的消化酶产生的协同作用，使对虾肠道内消化酶活性得到了提高。丁贤等[13]研究表明，在凡纳滨对虾基础饲料中添加芽孢杆菌，可显著提高对虾消化酶活性和成活率，有助于饲料的消化吸收，促进对虾生长。柴俊等[14]发现乳酸菌的主要代谢产物是乳酸，其次还有一些挥发性脂肪酸，能够降低机体肠道内的pH，从而可以达到抑制致病菌生长繁殖的作用。同时，它还具有细胞表面的蛋白抗原和黏液黏附受体蛋白等生理生化特征，已经作为益生菌广泛应用于陆生动物和鱼类养殖[15]。此外，乳酸菌能使无菌动物和常规小鼠肠道绒毛膜层细胞增殖，也能通过提高肠上皮细胞的成活率使肠道黏膜层的损伤修复[16]。该研究比较了在饲料中添加不同水平的侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和干酪乳杆菌对凡纳滨对虾生长及消化酶活性的影响。结果表明，试验组凡纳滨对虾存活率、增重率、摄食率和饵料系数显著高于对照组（P<005），并且能有效提高对虾肠道内消化酶的活力，使其能更好的吸收营养物质，促进机体的生长。 　　3.2微生態制剂对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响
　　凡纳滨对虾主要依靠非特异性免疫系统来抵抗外界的病原菌和疾病的侵染，维护机体的正常生长[17]。其中，体内所含的超氧化物歧化酶、酚氧化酶、碱性磷酸酶等活性是主要的评价指标[18]。胡毅等[19]研究表明，益生菌及其代谢产物能够提供良好的免疫激活剂，并通过激发机体的非特异性免疫来增强机体的抗病能力。其作用机理可能是通过细菌本身或细胞壁成分刺激非特异性免疫系统使其发挥作用，从而提高动物免疫力[20]。该研究通过正交试验比较了不同微生态制剂对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响，综合3因素不同水平的结果，筛选出添加量的最优组合方案，即LK（干酪乳杆菌）107 CFU/mL、NJ（侧孢芽孢杆菌）106 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢杆菌）107 CFU/mL。
　　3.3微生态制剂对水质的影响
　　养殖水体环境恶化是目前水产养殖业面临的主要问题之一，高密度养殖凡纳滨对虾，导致养殖后期水质污染严重，大量残余饵料以及动物的粪便和尸体成为了主要污染源，而其主要成分是蛋白质和淀粉。谢航等[21]、杭小英等[22]研究表明，地衣芽孢杆菌能在适宜的养殖水体水质条件下降解蛋白质与淀粉。同时芽孢杆菌本身也具有良好的脱氮去磷效果，如枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌具有明显去除氨氮和亚硝酸氮的功能[23]，在养殖水体中使用芽孢杆菌能有效降低水体中化学需氧量、氨氮和亚硝酸盐等有害物质，并将其转化为二氧化碳、硝酸盐和磷酸盐等[24-26]，从而为大量藻类生长繁殖提供其必需的营养，而这些藻类又能通过光合作用为水体提供氧气，从而形成一个良好的生态循环。干酪乳杆菌菌体能产生乳酸、抗菌肽等物质，能够抑制病原菌的生长，且能在养殖水体中直接或间接分解有机质和亚硝酸盐等物质。宋蓉等[27]研究表明干酪乳杆菌去除亚硝酸盐的机理包括胞内酶作用、代谢产物乳酸的直接化学反应作用和间接促进微生物反硝化作用3种作用机理，并阐述了其在养殖水体中主要以间接作用方式发挥作用，认为乳酸促进反硝化作用的原因在于为反硝化微生物提供了易于利用的有机碳源。该研究在凡纳滨对虾养殖水体中泼洒不同水平的侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和干酪乳杆菌。结果表明，尽管不同水平的3种微生物制剂对水体的净化程度不同，但整体上均优于对照组。经过正交试验优化了组合方案后泼洒于养殖池塘中，发现其对COD、氨氮、亚硝酸盐氮、总氮和总磷等均有不同的降解效果，并能有效提高凡纳滨对虾的养殖效益。
　　3.4微生态制剂的发展前景
　　目前，国内水产养殖业中运用较广泛的有光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、EM制剂等，这些微生态制剂在改善水质和作为饲料添加剂等方面已取得较好的效果。齐欣等[28]提出运用基因工程相关技术对优良菌种进行遗传改造，导入有效基因如必需氨基酸合成酶基因、疫苗基因等，并通过微胶囊技术对其进行包埋，使其在对虾养殖过程中发挥更好的作用。徐升[29]指出细菌和酵母菌是主要对养殖废水具有降解活性的微生物，而酵母菌是一种环境友好菌群，对环境更具安全性，且对有机污染物具有更强的耐受性，酵母菌作为将来的微生态制剂、饲料中的微生物添加剂和养殖水体的微生物调控剂都具有广阔前景。总而言之，微生态制剂在凡纳滨对虾养殖中被广泛地运用并用来替代抗生素将成为必然的发展趋势，且为凡纳滨对虾的绿色养殖提供了更为广阔的发展空间。
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