红线虫抗菌肽提取条件的工艺优化

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　　摘要：以红线虫（Limnodrilus hoffmeisteri）为材料，采用0.01 mol/L EDTA-2Na的0.9% NaCl溶液为浸提液提取有抑菌活性的多肽，以料液比、时间、pH值对红线虫抗菌肽提取条件进行3因素3水平正交试验优化提取工艺，并对处理结果进行多重比较。试验结果表明，红线虫抗菌肽对大肠杆菌没有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌有一定抑制效果;影响浸提效果的主要因素为料液比，次要因素为浸提时间和pH值，提取的最优处理组合：料液比1 g ∶ 15 mL，浸提时间8 h，浸提液pH值为7.2。
　　关键词：红线虫;抗菌肽;抑菌效果;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌
　　中图分类号： Q516;S188  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0191-03
　　抗菌肽（antimicrobial peptides）是许多生物自身合成的小分子碱性多肽[1]，最早被诱导并纯化的抗菌肽是惜古比天蚕（Hyalophora ceropia）产生的昆虫抗菌肽——天蚕素[2]，昆虫抗菌肽因其种类和品种繁多、分布广泛而被研究得最多[3]。抗菌肽具有很多特性，如杀菌谱广、耐热[4-5]，对真菌、细菌、病毒有抑杀作用，对病原虫以及异常增殖细胞有杀伤作用[6]，不易产生耐药性，可以中和内毒素，不会导致脓毒症等特性[7]。不同来源的抗菌肽被广泛应用，如蔬菜保鲜、医药[8]、食品添加剂[9]、作为饲料添加剂替代抗生素[10]，甚至在抗肿瘤的研究上受到普遍关注[11]。植物、哺乳动物、两栖动物、昆虫、细菌及病毒均会产生抗菌肽[12]，但针对红线虫抗菌肽的研究可谓鲜见。红线虫一般称为水蚯蚓或丝蚯蚓，常见于北方，属于环节动物门中的水生寡毛类，身体颜色多为鲜红色或暗灰色，外形与蚯蚓的幼体十分相似。它们大多数生活在江河的岸边，或成群聚集在河底污泥表层，具有生殖周期短、群体产量高、个体较小、易于操作、价格低廉等特点，所以选取红线虫为试验材料。本研究采用正交设计的方法优化从红线虫中分离抗菌肽的条件，并对不同处理进行多重比较，以探索提取抗菌肽最佳工艺，并为红线虫抗菌肽利用提供支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　1.1.1 材料 红线虫（Limnodrilus hoffmeisteri），购自河北省廊坊市花鸟虫鱼市场;金黄色葡萄球菌（Stap Hylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli），均购自中国普通微生物菌种保藏中心。
　　1.1.2 试剂 EDTA-2Na（AR，天津市东丽区天大化学试剂厂）、NaCl（AR，天津市致远化学试剂有限公司）、蛋白胨（LR，天津市大茂化学试剂厂）、酵母浸粉（LR，天津市大茂化学试剂厂）、琼脂粉（LR，北京普博欣生物科技有限公司）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（AR，天津市大茂化学试剂厂）、过硫酸铵（AR，天津市致远化学试剂有限公司）、甲差双丙烯酰胺（AR，北京化工厂）、丙烯酰胺（AR，天津市永大化学试剂有限公司）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，簡称SDS）（AR，天津市东丽区天大化学试剂厂）、磷酸二氢钠（AR，天津市天力化学试剂有限公司）、甲醇（AR，天津市致远化学试剂有限公司）、冰醋酸（AR，天津市天力化学试剂有限公司）、磷酸氢二钠（AR，天津市河东区红岩试剂厂）、考马斯亮蓝G-250（BS，天津市大茂化学试剂厂）。
　　所用培养基为LB培养基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，15 g琼脂，1 000 mL蒸馏水。
　　1.2 主要仪器设备
　　试验主要设备有ZHJH-C1115C超净工作台（上海智成分析仪器制造有限公司）、TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）、BCD-KFA冰箱（青岛海尔股份有限公司）、DW-86L386超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）、MLS-3750高压蒸汽灭菌锅[三洋电机株式会社（SANYO）]、ZDP-2270恒温培养箱（上海智成分析仪器制造有限公司）、ALPHA1-2冷冻干燥机（德国CHRIST）。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 样品预处理 取适量的红线虫，用蒸馏水洗净，吸干水分，平放于培养皿中摊开且保持适宜的厚度，将试验材料置于-70 ℃的冰箱中冷冻。
　　1.3.2 红线虫抗菌肽提取工艺及粗提取 借鉴已有抗菌肽提取工艺，选用含0.01 mol/L EDTA-2Na的0.9% NaCl溶液为浸提液，考虑料液比、浸提时间、pH值3个因素对抗菌肽提取的影响，设计3因素3水平正交试验（表1）。将冷冻后的红线虫取出放于研钵中加入液氮迅速研磨，待研磨充分后取 4 mL 研磨液于50 mL的离心管中，按照正交设计加入浸提液并置于4 ℃冰箱中浸提，每个处理重复3次。将上述研磨液浸提完成后在4 ℃、2 000 r/min 下离心20 min，取上清液冷冻干燥，获得抗菌肽的粗提物。将上述提取的抗菌肽粗提物放置于1.5 mL离心管中，于-20 ℃冰箱中进行冷冻保存。
　　1.3.3 红线虫抗菌肽粗提物活性的检测 采用牛津杯扩散法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为受试菌，用血球计数板计数法将2种菌配制成 107～108 CFU/mL 菌液，用移液枪各吸取100 μL置于LB平板中，采用涂布平板法将菌液涂布均匀。在涂布好的平板内均匀地放置5个牛津杯，并在其中各加入100 μL的100 mg/mL抗菌肽粗提物溶液，并作阴阳性对照。其中，阴性对照为相应的浸提液，大肠杆菌的阳性对照为20 U/mL庆大霉素，金黄色葡萄球菌的阳性对照为4 U/mL青霉素。把上述得到的平板在37 ℃条件下连续培养 24 h，观察抑菌效果，测量抑菌圈的直径，试验重复3次，计算平均值。
　　2 结果与分析 　　2.1 抗菌肽粗提物的抑菌效果
　　由图1可以看出，红线虫抗菌肽粗提物在 100 mg/mL 浓度下对金黄葡萄球菌有明显的抑制效果。由图2可以看出，红线虫抗菌肽粗提物在含有大肠杆菌的LB培养基中并没有出现相应的抑菌圈，所以红线虫抗菌肽粗提物在100 mg/mL浓度下对大肠杆菌没有抑菌效果。
　　2.2 影响红线虫抗菌肽提取工艺的因素
　　由表2可以看出，采用生物统计学中的直观分析法对所得数据进行分析，料液比的R值为2.94，远远超出了时间（0.83）和pH值（0.83）的R值，可见，料液比为影响红线虫抗菌肽抑菌活性的主要因素，浸提时间和pH值为影响红线虫抗菌肽抑菌活性的次要因素。天然多肽的提取方法多种多样，如盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等，但为保证抗菌肽粗提物抑菌活性而采取冷冻干燥的方法，所以限制采用有机溶剂、酸溶液提取的方法。
　　2.3 不同处理组合的抑菌效果
　　由表3可以看出，处理4～处理9均有明显抑菌效果，处理7、8的抑菌圈直径分别为11.67、11.83 mm，大于其他处理;其中处理7、8与青霉素抑菌直径之比分别达到0.56、0.57（表2），最优水平组合为A3B2C1（表3），正好为处理8，所以处理8为红线虫的最佳处理组合，即料液比1 g ∶ 15 mL，浸提时间为 16 h，浸提液pH值为6.8。
　　由表3还可以看出，处理9与其他处理间均无显著差异，处理7、8和处理4、5、6有显著差异，但处理7、8之间差异并不显著，所以在实际应用中，选用处理7作为优化红线虫提取工艺。对比处理8、9发现，并不是浸提时间越长效果越好，相反浸提时间过长反而会引起抑菌效果减弱。
　　红线虫抗菌肽还可以进一步纯化，经过SDS-PAGE确定分子量，再进行抗菌谱测定，根据其抗菌谱可以尝试在食品保鲜、农药、兽药或医药领域进行应用。
　　3 结论
　　本研究根据前人的工作基础，首次以红线虫为试验材料，考虑料液比、浸提时间、pH值，设计3因素3水平正交试验，以浸提粗制品的抑菌活性为指标，确定影响提取工艺的关键因素，优化红线虫抗菌肽提取工艺。结果表明，红线虫抗菌肽粗提物对金黄色葡萄球菌有一定的抑制效果，但对大肠杆菌却没有明显的抑制效果;影响红线虫抗菌肽抑菌效果的主要因素是料液比，次要因素是pH值和浸提时间，且提取的最优处理组合为料液比 1 g ∶ 15 mL，浸提时间16 h、浸提液的pH值6.8。
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