两类破壁灵芝孢子粉三萜的提取工艺优化及其含量测定

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　　摘要 [目的]优化CO2超临界萃取孢子油后的破壁灵芝孢子粉残渣和破壁灵芝孢子粉中三萜类成分提取工艺以及CO2超临界萃取孢子油前后三萜类成分的含量差异。[方法]通过设计正交试验，采用紫外-可见分光光度法测量提取液的吸光度，计算提取率，根据正交数据分析，确定最佳提取方案以及含量差异。[结果]对于CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉来说，最佳提取工艺为以无水乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶30（g∶mL），提取时间为2 h，提取温度为70 ℃，提取次数为4次时提取率最高;对于破壁灵芝孢子粉来说，最佳提取工艺为以无水乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20，提取时间为1.5 h，提取温度为50  ℃，提取次数2次时提取率最高;且二者三萜类成分含量存在于有明显差异。[结论]该研究为进一步分析破壁灵芝孢子粉在CO2超临界萃取孢子油前后三萜类成分含量差异提供理论依据和参考。
　　关键词 破壁灵芝孢子粉;提取工艺优化;含量测定;方法学考察;正交试验设计;紫外-可见分光光度法
　　中图分类号 R284  文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）19-0182-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.048
　　Abstract [Objective]To optimize the extraction process of triterpenoids from the residues of spore powder of Ganoderma lucidum and spores of Ganoderma lucidum after CO2 supercritical extraction of spore oil and the difference of triterpenoids content before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.[Method]By designing an orthogonal experiment，the absorbance of the extract was measured by UVvis spectrophotometry，the extraction rate was calculated，and the optimal extraction scheme and content difference were determined based on the orthogonal data analysis.[Result]The best extraction process for the broken Ganoderma lucidum spore powder after CO2 supercritical extraction of Ganoderma lucidum spore oil： absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶30，and the extraction rate was highest when the temperature was 70  ℃ for 2 h and the number of times was 4 times.For Ganoderma lucidum spore powder，the best extraction process was： using absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶20，the extraction time was 1.5 h，the extraction temperature was 50 ℃，and the extraction rate is the highest;and the content of triterpenoids in the two was significantly different.[Conclusion]The study provides a theoretical basis and reference for further analysis of the content difference of triterpenes in the broken Ganoderma lucidum spore powder before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.
　　Key words Broken Ganoderma lucidum spore powder;Optimization of extraction process;Content determination;Methodological investigation;Orthogonal experimental design;Ultravioletvisible spectrophotometry
　　基金項目 安徽省科技重大专项（17030801015）。
　　作者简介 温艳艳（1995—），女，安徽濉溪人，硕士研究生，研究方向：药学。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事药物制剂新技术与药物体内外分析研究。
　　收稿日期 2020-01-03;修回日期 2020-03-06
　　灵芝（Ganodermo lucidum）属于担子菌纲多孔菌科真菌，是我国名贵的传统中药材，在中国有上千年的药用历史，又名“琼珍”，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品[1]。灵芝孢子粉是在灵芝成熟后从菌褶中弹射出来的微小的生殖细胞，也是灵芝的种子，具有灵芝的全部遗传物质，其形态极其微小（4～6 μm），一般条件下想要自然收集很困难。近年来经证实灵芝孢子粉主要具有抗癌抗肿瘤活性[2-4]、保护神经系统[5-6]、保肝护肝[7-8]、降血脂[9]、降血糖[10]、调节机体免疫力[11-12]等作用。此外，灵芝孢子粉类药物被广泛应用于临床方面，且安全无毒。 　　灵芝三萜一般可以从不同种类的灵芝中分离提纯获得，且灵芝三萜在灵芝中的含量多少常被作为评判灵芝质量的标准之一[13]。1982年，Kubota等[14]首次从灵芝中分离出2种灵芝酸成分，即灵芝酸A、B，目前为止已鉴定出的灵芝三萜的种类达300多种[15]。灵芝三萜类成分结构复杂，具有高度氧化性的羊毛甾烷衍生物，分子量一般在400～600 Da，脂溶性较高，难溶于水。三萜多数具有苦味，苦味越强则三萜含量越高，从灵芝子实体、孢子粉、菌丝体等的提取物中分离出多种三萜类成分，大多数以灵芝酸为主[16]。
　　破壁灵芝孢子粉价格昂贵，且对于考察灵芝孢子粉的质量目前没有一个确切的科学评价体系，对于其药理作用、临床应用以及相关药物研发领域研究等都发现与其活性成分密切相关。有研究表明，破壁灵芝孢子粉CO2超临界萃取孢子油后，其中三萜类成分也会相应地被提取出来[17]，为避免资源浪费，对其中剩余三萜类成分进行提取，可以实现资源利用最大化。
　　应要求采用有机溶剂回流提取法对两类破壁灵芝孢子粉中三萜类成分进行提取，在提取过程中，提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数、料液比等都会对提取率有一定的影响，因此采用正交法对提取方案进行优化，正交设计作为一种高效经济且可以同时对多种影响因素进行考察的试验设计方法[18]，可以有效选取对灵芝孢子粉中三萜类成分提取的最优影响因素，获得最佳提取工艺，近年来被广泛应用于中药领域，尤其是中药中有效成分的提取分离。笔者通过紫外-可见分光光度法进行含量测定，比较萃取灵芝孢子油前后三萜类成分含量差异，从而更客观地评价灵芝孢子粉质量。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药材。
　　CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉残渣、破壁灵芝孢子粉，由黄山云乐灵芝有限公司提供。
　　1.1.2 试剂。
　　无水甲醇、无水乙醇、冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯，上海润捷化学试剂有限公司，均为分析纯;高氯酸，国药集团化学试剂有限公司，优级纯;齐墩果酸标准品，纯度： HPLC≥98%，批号 CHB171229，成都克洛玛生物科技有限公司。
　　1.1.3 仪器。
　　十万分之一分析天平、千分之一分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司;旋转蒸发仪，德国heidolph;恒温水浴锅，上海越众仪器设备有限公司;紫外-可见分光光度计，UV-8000，上海元析分析仪器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司;抽滤装置，北京欣维尔玻璃仪器有限公司;全波长扫描仪，德国耶拿分析仪器股份有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 对照品溶液的配制。
　　精密称取齐墩果酸对照品10.00 mg，用无水甲醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，待用。
　　1.2.2 供试品溶液的制备。
　　精密称量2 g破壁灵芝孢子粉、CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉残渣，分别置于500 mL容量瓶中，通过设计正交试验，在不同试验条件下对破壁灵芝孢子粉、CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉残渣分别进行有机溶剂回流提取三萜类成分，将提取液经减压抽滤，合并滤液，对获得的澄清滤液用旋转蒸发仪于70 ℃水浴浓缩至少于25 mL，采用25 mL容量瓶用相应的提取溶剂进行定容至25 mL混匀，制得供试品溶液。
　　1.2.3 最大吸收波长的确定。
　　精密量取0.6 mL对照品溶液于10 mL试管中，于50 ℃烘箱中挥干，放冷，精密加入0.2 mL香草醛冰醋酸溶液（精密称量香草醛粉末500 mg，置于10 mL容量瓶中，用冰醋酸配制成50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液）、0.8 mL高氯酸溶液，混匀，于70 ℃水浴加热15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，混匀，制得待测标准品溶液;并用相应试剂制备空白溶液，作为参比溶液，利用紫外全波长扫描仪于200～800 nm进行全波长扫描，绘制吸光度-波长曲线，确定最大吸收波长。
　　1.2.4 方法学考察。
　　1.2.4.1 线性关系考察。分别
　　精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL试管中，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，绘制吸光度（y）与浓度（x）曲线，计算线性回归方程。
　　1.2.4.2 精密度。
　　精密量取对照品溶液0.6 mL，于10 mL试管中，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，重复测定6次，计算RSD。
　　1.2.4.3 重复性。精密量取100 μL CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉的供试品溶液、25 μL破壁灵芝孢子粉的供试品溶液，各6份于10 mL试管中，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，计算RSD。
　　1.2.4.4 稳定性。
　　精密量取100 μL CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉的供试品溶液、25 μL破壁灵芝孢子粉的供试品溶液于10 mL试管中，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，每隔10 min测定一次吸光度，测定1 h，自第2小时起，每隔1 h测定一次吸光度，计算RSD。
　　1.2.4.5 加样回收率。分别精确吸取已知三萜含量的CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉供试品溶液50 μL于9支10 mL试管中，分成3份，分别加入1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2对照品溶液，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，计算回收率和RSD。 　　分别精确吸取破壁灵芝孢子粉供试品溶液5 μL于9支10 mL试管中，分成3份，按上述方法加入对照品溶液，并同法操作。
　　1.2.5 灵芝三萜含量测定。
　　精密量取100 μL CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉的供试品溶液、25 μL破壁灵芝孢子粉的供试品溶液于10 mL试管中，自挥干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波长处测定吸光度，根据线性回归方程，计算灵芝三萜的含量。
　　1.3 正交试验设计 该试验主要采用有机溶剂回流提取，考察提取溶剂（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）、提取次数（E）5个因素对CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子粉中三萜类成分提取率的影响，设计L16（45）正交试验，见表1。
　　1.4 验证试验
　　对正交试验结果进行分析，获得最佳试验方案，在最佳试验方案条件下提取破壁灵芝孢子粉、CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉中的三萜类成分，并测定三萜类成分含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 最大吸收波长 从灵芝三萜类成分在200～800 nm的吸光度-波長曲线（图1）可以看出，灵芝三萜类成分在波长为548 nm处获得最大吸光度，因此选择548 nm作为最大吸收波长进行后续试验。
　　2.2 方法学考察
　　2.2.1 线性关系考察。按“1.2.4.1”操作，计算得出线性回
　　归方程y=2.290 2x-0.086 6，R2=0.999 1（n=6），结果表明三萜浓度在8.00～41.00 μg/mL稳定。
　　2.2.2 精密度。按“1.2.4.2”操作，计算出吸光度的RSD为0.077%（n=6），表明仪器具有较好的精密度。
　　2.2.3 重复性。按“1.2.4.3”操作，计算出CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉三萜提取液吸光度的RSD分别为0.253%、1.254%（n=6），表明该方法重复性较好。
　　2.2.4 稳定性。按“1.2.4.4”操作，计算出CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉的三萜提取液2 h内吸光度的RSD为1.650%，表明在2 h内具有较好的稳定性;破壁灵芝孢子粉三萜提取液在1 h内吸光度的RSD为1.157%，表明该方法在1 h内具有较好的稳定性。
　　2.2.5 加样回收率。按“1.2.4.5”操作，破壁灵芝孢子粉和CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉三萜提取液加样回收率结果见表2、3，表明该方法准确、可靠，适用于三萜类成分的测定。
　　2.3 正交试验
　　由表4可知，对于破壁灵芝孢子粉来说，各提取因素对其三萜提取率的影响从大到小依次为A、D、B、E、C，破壁孢子粉三萜最佳提取工艺为A3B1C2D1E2，即无水乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20（g∶mL），提取时间1.5 h，提取温度50 ℃，提取次数2次。对于CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁孢子粉来说，各因素对三萜提取率的影响从大到小依次为B、E、A、D、C，CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉三萜最佳提取工艺为A3B2C3D3E4，即无水乙醇为提取溶剂，料液比为1∶30，提取时间2.0 h，提取温度70 ℃，提取次数4次。
　　为分析不同影响因素对两类破壁灵芝孢子粉中三萜类成分提取率影响的显著性，对正交试验结果进行方差分析，结果发现，提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度、提取次数对灵芝三萜类成分提取率均具有显著影响（P<0.05）。对于破壁灵芝孢子粉，提取溶剂对其提取率影响较大;对于CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉，料液比是影响其提取率的主要因素。
　　2.4 验证试验
　　对经正交试验得到的最佳提取工艺进行验证，得CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉三萜提取率为1.69%，破壁灵芝孢子粉三萜提取率为12.29%，故证明所确定的2种提取工艺为最佳提取工艺。
　　3 结论与讨论
　　由方法学考察结果可知，采用紫外-可见分光光度法测定灵芝孢子粉中三萜类成分的可行性良好。通过正交试验考察提取溶剂、料液比、提取温度、提取时间、提取次数对两类破壁孢子粉三萜提取率的影响，发现在一定程度下不同因素对两类破壁灵芝孢子粉提取率的影响不尽相同，对于破壁灵芝孢子粉，提取溶剂对其提取率影响较大，且其最佳提取工艺为无水乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶20，提取时间为1.5 h，提取温度为50 ℃，提取次数2次;对于CO2超临界萃取灵芝孢子油后的破壁灵芝孢子粉，料液比是影响其提取率的主要因素，且最佳提取工艺为无水乙醇为提取溶剂，料液比为1∶30，提取时间为2.0 h，提取温度为70 ℃，提取次数4次。
　　目前多数学者多采用有机溶剂作为提取溶剂，相对于氯仿、乙酸乙酯来说不同浓度乙醇、甲醇毒性较小，价廉易得，适用于工业化生产。回流提取具有提取量大、操作简单、适用范围广等优点，目前被广泛应用于工业化生产。设计正交试验方案，对各种因素的影响进行综合考察，进一步缩短试验时间，减少资源损耗。采用紫外-可见分光光度法进行含量测定，并进行方法学试验考察该方法的可靠性，然后根据试验中测得的吸光度计算两类孢子粉中三萜类成分的提取率，比较含量差异，并根据正交试验的结果进行数据分析，探讨各因素对结果的影响效果，综合考察得出最佳提取工艺。
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