中华卤虫（Artemia sinica）家系构建的几个关键技术

来源:用户上传      作者:张志伟 李龙 罗耀明 战杰 张晓芳 潘萍萍

　　摘 要：为研究中华卤虫（Artemia sinica）家系构建过程中休眠卵收集参数以及影响其生殖方式的环境条件，实验利用中华卤虫四个地理品系野生卵在实验室条件下孵化培养后，通过品系间和品系内的交配繁殖所产生的F1代休眠卵为材料进行家系构建，一共成功构建了188个家系，其中29个半同胞家系。对各家系休眠卵的收集参数统计分析结果表明，多数家系在抱对后96 h内便产生后代，但在抱对145 h后产后代家系数明显减少，并以生产2批卵的家系最多，可以生产4批卵以上的家系较少。各家系产后代个数统计结果显示，以产卵量在151～200粒之间的家系最多。“可人工调控生殖方式”实验结果表明，促其营卵生的条件是盐度77‰、饵料21.43 mg/2只。促其营卵胎生的条件是盐度30‰、饵料53.57 mg/2只，因而在家系构建时可以利用“可人工调控生殖方式”来促其产生后代，以建立较多数量的家系来扩大选育种质资源，这或许也是解决半同胞家系构建困难的一个策略。
　　关键词：中华卤虫（Artemia sinica）;家系构建;关键技术
　　中华卤虫（Artemia sinica）是我国的一种两性生殖卤虫群体，属于节肢动物门（Arthopoda），有腮亚门（Branchiata），甲壳纲（Crustacea），腮足亚纲（Branchiopoda），无甲目（Anostraca），卤虫科（Artemiidae），卤虫属（Artemia），在北方，卤虫群体有山西运城群体、内蒙古阿拉善左旗群体、内蒙古伊克昭盟群体等。卤虫是一种耐高盐度的世界性分布的小型甲壳动物[1]，种质资源十分广泛。卤虫个体小，繁殖周期短，约2～3个月，易于操作和配种，生殖方式有卵生和卵胎生两种[2]，在控制环境条件下可以对其生殖方式进行人工调控，适合作为构建水产动物多世代遗传评定的模式生物。因此，本文探索了家系后代收集的基本参数及影响卤虫产生休眠卵和产生幼体的盐度、饵料条件，最终达到“可人工调控其生殖方式”的目的。例如：调控产卵条件，可以获取充足的家系种质备份，方便遗传进展和多样性的对比分析。而调控产幼体条件，可以缩短中华卤虫家系选育周期，这样便能在短时间内建立多世代繁殖群体。
　　 家系构建是对水产动物性状进行遗传评估的重要手段[3]。家系指由共同亲本繁衍下来的若干世代。家系选择（family selection）是指以家系为单位，以各家系受选择性状的平均值为标准所进行的选择育种[4]。构建家系开展遗传选育凭其周期短、操作简便、效果好、可抑制遗传衰退、是分子育种的基础等优点已成为海水养殖良种培育体系的主体力量[5]，而有关中华卤虫家系构建的相关研究未见报道。
　　 本实验就中华卤虫家系构建过程中家系后代收集参数以及影响其生殖方式的环境条件进行了研究，以期为中华卤虫的家系选育提供重要的技术支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　所用材料为中华卤虫（Artemia sinica）四个地理品系野生卵在实验室条件下孵化培养后，通过品系间和品系内交配繁殖所产生的F1代休眠卵。各品系的产地和代码等信息见表1。其中的SIN品系和YIM品系由比利时国际卤虫参考中心的G. Van Stappen 博士和P. Sorgeloos博士提供，ALXZ品系、BDJL品系由中国海洋大学孙世春博士提供。
　　1.2 孵化与培养条件
　　 2018年11月24日开始孵化F1代休眠卵，在400 L光照培养箱中进行，孵化条件为温度26 ℃、盐度30‰、全天光照（光照强度3 000 lx），孵化时间36 h。随机选取在相同时间孵出的卤虫幼体50只到500 mL的烧杯中按1个/10 mL标准进行暂养10 d。培养温度为25 ℃，盐度为77‰，全天光照（3 000 lx），每3 d换水一次。饵料为盐生杜氏藻（Dunaliella salina），培养温度为25 ℃，盐度为77 ‰（盐度调节采用向自然海水中加NaCl的方法），光照大约为3 000 lx，光照周期为12 h黑暗/12 h光照[6]。
　　 养殖到第10日龄时，把每个个体单独转移至50 mL透明塑料小瓶中按1个/35 mL标准单独养殖，并对小瓶进行单独编号，以实现各性状值与个体准确对应，同时避免了因家系内雌雄个体抱对和雄性个体相互抱持在一块而降低有效个体数量。
　　1.3 家系构建
　　 将个体养殖至第20日龄时，测定其个体水平上的体长、体重性状值。在解剖镜下利用目微尺测量体长。通过精确度为万分之一的电子天平测定体重，并记录测量日期、时间，个体所处的养殖环境信息，以便对数据进行更加准确的校正。同时，每个家系设置多个重复以降低因环境差异而对实验数据造成的影响。
　　 根据测得性状值利用Asreml软件计算个体选择指数并选择留种个体，2018年12月29日开始建立家系，方法是将选择指数大于97且相互之间没有亲缘关系的个体按照选择指数高低依次进行配对，将1雌1雄配对后单独培养于50 mL透明塑料小瓶。每天检查各家系产后代情况，及时分离产出的后代。2019年1月28日实验结束，共计63 d。
　　1.4 生殖方式的环境调控
　　 随机选取规格相当的雌雄个体，按照一雌一雄配对置于50 mL医用小瓶中进行养殖管理。养殖期间直至交配產生后代均按35 mL水体/2只进行标准化养殖，并记录各家系产后代情况。饵料为澳帝力精纯螺旋藻片。
　　 实验设置3个盐度条件：分别为30‰、60‰、77‰，2个饵料条件（一个饵料富足条件、一个饵料缺乏条件），根据预实验结果将饵料投喂标准定为每天投饵一次，投饵量为21.43 mg /2只、5357 mg /2只。一共设置6个实验组，A1组：盐度30‰，投饵量为21.43 mg /2只，A2组：盐度30‰，投饵量为53.57 mg /2只。B1组：盐度60‰，投饵量为21.43 mg /2只，B2组：盐度60‰，投饵量为53.57 mg /2只。C1组：盐度77‰，投饵量为21.43 mg /2只，C2组：盐度77‰，投饵量为53.57 mg /2只，每个实验组设30个实验样本，同时每个实验条件下设置一个重复。 　　2 结果
　　2.1 20日龄卤虫体长、体重性状值描述统计
　　 中华卤虫第20日龄体长值、体重值分别介于5 690.60～13 634.40 μm、3.5～41.0 mg之间。体长、体重变异系数差别较大，分别为18.79%、52.74%，表明体重较体长有较大的选育空间。
　　2.2 各家系最早抱对与最早产后代时间间隔
　　 本文共成功建立了188个家系。各家系最早抱对与最早产后代时间间隔见图1，结果表明多数家系在抱对后96 h内便产生后代，产后代高峰出现在抱对后72～96 h，其次为抱对后1～24 h。另外，抱对后121～144 h产后代家系数量也较多，但在抱对145 h后产后代家系数明显减少。
　　2.3 各家系产卵批次及产后代数量统计
　　 各家系产卵批次统计结果表明（图2），以生产2批卵的家系最多，其次为生产1批卵和生产3批卵的家系，但可以生产4批卵以上的家系较少。各家系产后代个数统计结果见图3，前4个产卵数量段分布的家系数均超过25个，以产卵量在151～200粒之间的家系最多，但仍有34个家系的产卵总量在10～50粒，并且有32个家系产生幼体。2.4 生殖方式的环境调控
　　 图4结果表明，产卵方面，C1、C2组条件下产卵家系数均大于B1、B2、A1、A2组，并以C1组产卵家系数最多。产幼体方面，低盐度条件能明显促进卤虫产幼体。而且在53.57 mg/2只的饵料条件下产幼体家系比例有较大提高，如A2、B2、C2组。
　　3 讨论
　　3.1 大规模家系构建的成功丰富了育种种质资源
　　建立家系进行良种选育已在虾、鱼类中取得显著成绩。张天时等[7]利用人工授精技术成功建立了101个中国对虾家系，其中半同胞家系29个，为以后的选择育种研究和家系选育打下了坚实基础。杨国梁等[8]利用罗氏沼虾3个群体，通过巢式交配设计成功建立了123个家系，其中半同胞家系37个。张建森等[9]利用大规模建鲤育种基础群（千万尾）选育繁育群体（2 000～2 500尾）按雄雌比1∶2建立家系，对建鲤进行了3代选育和生产验证，结果表明比选育前建鲤群体增重快13.6%～15.1%。伴随选择育种技术的迅猛发展以及无序的养殖生产，不可避免地产生一些消极影响，譬如，病害频发、个体小型化[10]、遗传多样性下降、近交衰退，究其最终原因是种质资源匮乏即有效群体数较小[11]，因此，扩大选育群体、增加有效群体数量便迫在眉睫。通过大规模家系构建来丰富种质资源储备不失为解决这一问题直接有效的方法。
　　 本实验成功建立了188个家系，其中29个半同胞家系，为中华卤虫家系选育提供了丰富的种质资源，并对各家系休眠卵的收集参数进行了统计分析，结果表明多数家系在抱对后96 h内便产生后代，产后代高峰出现在抱对后72～96 h，而在抱对145 h后产后代家系数明显减少。并以生产2批卵的家系最多，但可以生产4批卵以上的家系较少。这与周可新等[12]的研究结果一致。各家系产后代个数统计结果显示，前4个产卵数量段分布的家系数均超过25个，以产卵量在151～200粒之间的家系最多，但有32个家系产生幼体即营卵胎生。这些参数的获得可以指引中华卤虫大规模家系构建有的放矢，为家系选育打下坚实基础。
　　3.2 半同胞家系构建存在的难点及可行的解决方案
　　本实验成功建立了29个半同胞家系，占家系总数比例较上述报道偏低，原因之一是受雄性个体生殖活力限制，半同胞家系建立方法是先将雄性个体与一个雌性个体交配，待交配产卵结束雌雄个体自动分开后再将该雄性个体与另一个雌性个体交配建立家系，这样使得雄性个体在与第一个雌性个体交配时消耗了大量的精子而造成了与第二个雌体的交配困难，同时，又因卤虫个体较小而无法将精子取出后直接注入到雌性个体的卵囊中，这样就直接导致了中华卤虫半同胞家系构建的困难。原因之二是没有找到合适的环境条件来诱导其产生后代。黄成等[13]研究发现诱导大盐湖卤虫（Artemia francisana）和东营卤虫（Artemia sinina）产休眠卵的最佳条件分别是盐度90‰、温度10 ℃或者15 ℃，盐度90‰、温度15 ℃，而有关本实验所用中华卤虫四群体尤其是在饵料条件上诱导后代产生的相关研究未见报道。
　　 基于上述情况，本实验对中华卤虫的“可人工调控生殖方式”在盐度、饵料水平上进行了研究，结果表明产卵方面，C组条件下產卵家系数均大于B组、A组条件，并以21.43 mg/2只的饵料条件产卵家系数最多。产幼体方面，低盐度条件能明显促进卤虫产幼体。而且在53.57 mg/2只的饵料条件下产幼体家系比例有较大提高。因此，促其营卵生的条件是盐度77‰、饵料21.43 mg/2只。促其营卵胎生的条件是盐度30‰、饵料5357 mg/2只，进而在家系构建时可以利用“可人工调控生殖方式”来促其产生后代，以建立较多数量的家系来扩大选育种质资源，这或许也是解决半同胞家系构建困难的一个有效策略。
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　　Several key techniques in family construction of Artemia sinica
　　ZHANG Zhiwei1， LI Long1， LUO Yaoming2， ZHAN Jie1， ZHANG Xiaofang1， PAN Pingping1
　　（1. Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co.，Ltd. Yantai 264003， China;2.Dalian Modern Agricultural Production Development Service Center，Dalian 116023，China）
　　Abstract：Several key techniques in family construction of A.sinica were studied. The artemia  in this experiment was the F1 offspring of the 4 domestic populations by using self- and hybrid-mating.188 full-sib families，29 sub-sib families were obtained. The quantitative statistics of collecting offspring for each family showed that the first batch of offspring being produced in 96 h ，in most families， after the clasping phenomenon being observed for the first time， but there was a linearly decrease of offspring produced after 145 h. The total offspring number ranged from 151 to 200 with 2 batches produced in most of the families. The “artificial control mode of reproduction” experiment gave us a result that the reproduction mode could be controlled with the salinity 77‰ and food 21.43 mg/2samples for producing cysts（C1）， while with the salinity 30‰ and food 53.57 mg/2samples for producing larvae（A2）， respectively. Therefore， this mode can be used to construct a large amount of families， and it might be a method for sub-sib families construction.
　　Key words：Artemia sinica; family construction;key techniques
　　（收稿日期：2020-10-27;修回日期：2020-11-12）
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