火龙果组培技术研究进展

来源:用户上传      作者:叶维雁 欧景莉 覃少麟 潘如军 苏展 徐有海 郑文武 覃剑峰

　　摘要 火龙果集观赏、食用和保健功能于一身，是一种新兴的热带亚热带果树，果实风味独特、营养丰富。该研究从外植体的选择和消毒、培养基的选择、不定芽的诱导和增殖、愈伤组织的诱导和增殖、愈伤组织的诱导分化和生根培养等方面对火龙果组织培养技术的研究现状进行了综述，并提出了今后的展望，旨在为火龙果组培技术的进一步发展提供科学依据。
　　关键词 火龙果;组织培养;技术
　　中图分类号 Q813.1+2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）05-0035-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.009
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Research Progress on Tissue Culture Technology of Pitaya
　　YE Wei-yan1， OU Jing-li1， QIN Shao-lin2 et al
　　（1. Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001; 2 Guangxi Mountainous Area Comprehensive Technology Development Center， Nanning， Guangxi 530012）
　　Abstract Pitaya is a new tropical and subtropical fruit tree with ornamental， edible and healthcare functions， the fruit has unique flavor and rich nutrition. In this research， the research status of pitaya tissue culture technology was reviewed including explant choice and sterilization， medium selection， adventitious bud induction and proliferation， callus induction and proliferation， callus differentiation and rooting culture. Finally the future prospect was presented， so as to provide scientific basis for the further development of pitaya tissue culture technology.
　　Key words Pitaya;Tissue culture;Technology
　　火龙果（Hylocereus undulates Britt.）又称红龙果、青龙果和仙蜜果等，是仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）多年生植物[1-2]，集观赏、食用和保健功能于一身，原产于南美、北美及中美州热带地区，目前在我国的广西、海南、广东、云南、福建等地都有大规模种植，是一种新兴的热带亚热带果树[3-6]。果实风味独特，营养丰富，含有丰富的茶多酚、维生素、天然色素和水溶性膳食纤维，以及植物性白蛋白、植物甾醇类化合物、功能性氨基酸和多糖等物质，经常食用能降血压、降血脂、润肺、解毒、养颜、明目，对便秘和糖尿病也有辅助治疗的作用，对人体健康非常有益[7-14]。火龙果的繁殖方式有种子繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖和组织培养繁殖等，其中组织培养不仅可在短期内获得大量苗木，还可快速大量地保存优良种质，对火龙果的快速、周年性生产以及大范围推广种植具有积极的推动作用。目前，对火龙果组织培养的研究较多，取得了一定成果。鉴于此，笔者从外植体的选择、组培再生途径、生根培养等方面对火龙果组织培养技术进行综述，以期为相关科研工作者和生产者提供参考，促进火龙果组培技术的进一步发展。
　　1 外植体
　　1.1 外植体的选择
　　外植体的选择是植物组织培养的关键，外植体选择的合适与否直接影响消毒、无菌体系建立以及整个组培流程的难易程度[15]。火龙果组织培养以茎段、花药和无菌种胚所发幼芽等为外植体，经合适的灭菌过程，建立无菌体系。目前火龙果组织培养大多采用茎段作为外植体，王云山等[16]以3 cm长的火龙果幼嫩茎段为外植体诱导愈伤组织，诱导率达100%。黄春华等[17]分别采集新抽嫩茎段、近成熟茎段和老熟茎段作为外植体进行组织培养试验，结果表明近成熟茎段是“蜜宝”火龙果组培最佳外植体。洪青梅等[18]以火龙果近成熟茎为外植体诱导不定芽，诱导率达80%。彭绿春等[19]认为，保留刺座上小刺和绒毛的火龙果茎段更利于诱导不定芽萌发，提高其组培快繁效率。黄青峰[20]以火龙果带剌座棱片切块为外植体，直接诱导其剌座不定芽生长，继而分化、增殖、生根成苗和移栽。范建新等[21]用火龙果花药诱导出愈伤组织，增殖获得大量胚性愈伤组织，再分化形成了不定芽。利用火龙果无菌种胚所发幼芽作为外植体，可避免成熟茎段作为外植体易带菌、易污染等缺点，具有再生能力强、长势均一等优点[22-24]。黄红梅等[25]确定了火龙果子叶的愈伤组织诱导效果最好，子叶愈伤组织可以较容易诱导分化产生不定芽，印证了Infante[26]的观点，即火龙果子叶是诱导愈伤组织的主要外植体来源。彭思维[27]认为，火龙果种子诱导萌发率高，对灭菌条件和基本培养基要求不高，能够一次性诱导出大量无菌外植体，对于大量试验十分有利。
　　1.2 消毒处理
　　采取外植体后，要对外植体进行消毒，这是植物组织培养中一个非常重要的环节。消毒剂的种类、浓度和作用时间等对消毒的成功十分重要。选择的消毒剂既要将外植体表面的微生物彻底杀死，又要易于清洗或能够自行分解，还要尽可能保护外植体组织和表层细胞。目前常见的消毒剂有乙醇（浓度70%～75%）、氯化汞（浓度0.1%～02%）、次氯酸钠（浓度2%）、次氯酸钙（浓度5%～10%）和双氧水（浓度3%～10%）等[28-29]。李清香等[30]使用75%乙醇消毒20 s、0.1%升汞消毒10～15 min的组合对“金都一号”火龙果新萌芽的茎段进行表面消毒，污染率為55.70%，并发现芽眼的刺座处一般污染比较严重。彭思维[27]认为火龙果茎段消毒0.1%升汞的最佳处理时间为8 min，而种子消毒则以0.1%升汞浸泡4 min以上和3%次氯酸钠浸泡12 min以上即可达到有效的消毒作用，且种子的成活率和萌发率不受影响。王云山等[16]以火龙果母茎上的新生茎段为外植体，用0.1%升汞消毒15 min的污染率最低，但会导致材料大部分刺座及茎棱组织有褐化并逐渐坏死的现象，说明15 min的消毒时间过长，茎段组织细胞被杀死。邢玉良[31]取火龙果一年生幼嫩无病虫害枝条，切成长2～4 cm的茎段，用自来水冲洗2 h，在超净工作台上用75%乙醇浸泡茎段并摇晃30 s，无菌水冲洗4～6次，再以0.1%升汞浸泡8 min，最后用无菌水冲洗4～6次，结果污染率低至9.2%。 　　2 基本培养基
　　培养基作为植物组织培养的重要材料和营养来源，其组成成分直接影响外植体的脱分化与再分化状态，是起决定性作用的因素，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养成功。目前火龙果组织培养使用的基本培养基以MS和1/2 MS培养基最普遍。MS培养基主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、K+和NH+ 4的含量高，各元素之间平衡较好，微量元素和有机物的种类较多，适用于多数营养需求量较大的植物，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。
　　3 组织培养再生途径
　　目前火龙果组织培养体系的建立主要有2种方式，即直接器官发生途径和间接器官发生途径。直接器官发生途径指不经过愈伤组织阶段，直接从外植体上诱导产生腋芽或不定芽，再进行增殖培养，产生丛生芽，最后进行生根培养;间接器官发生途径指由外植体脱分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化形成不定芽，最后诱导不定芽生根。
　　3.1 直接器官发生
　　直接器官发生途径周期短，所获得的再生植株不易发生变异，是火龙果离体快繁的有效途径。植物生长调节剂在培养基中的用量虽然微小，但其作用很大[32]，在火龙果组织培养不定芽的诱导中，细胞分裂素6-BA起着重要的调控作用，6-BA单独使用或与其他植物生长调节剂组合可起到良好的效果。张领等[33]采用MS+6-BA 40 mg/L+NAA 0.5 mg/L的组合，火龙果不定芽诱导率达58.33%，继代培养将6-BA浓度提高为9.0 mg/L时，增殖倍数达到12。黄青峰[20]以6-BA 5.00 mg/L、NAA 0.05 mg/L的组合诱导不定芽效果最好，诱导率达75%，增殖培养基用MS+6-BA 5.00～8.00 mg/L+NAA 0.05～0.10 mg/L，继代周期45 d，平均繁殖系数为4.5。牟海飞等[34]认为6-BA浓度为4.0 mg/L时“桂红龙1号”芽的诱导效果最佳，6-BA浓度越高，芽增殖倍数越高，但当6-BA达到4.0 mg/L时，芽出现玻璃化现象，IAA的芽增殖效果优于NAA，当IAA为0.1 mg/L时芽增殖效果较好，在培养基中添加PP 333对抑制玻璃化和促进火龙果组培苗继代增殖的效果优于AC。何小帆等[1]以培养基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L诱导红心火龙果不定芽，发芽率达87.03%，以培养基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+AC 0.2 g/L增殖不定芽，增殖系数高达7.33。彭绿春等[19]选用培养基MS+6-BA 2.0～4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+TDZ 0.4～0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L诱导不定芽，诱导率达80%，以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L为增殖培养基，增殖系数达6.4，并发现活性炭对火龙果茎段增殖有一定的抑制作用。刘洪章等[35]试验得出火龙果组培快繁最好的增殖培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L，最好的伸长培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 10 mg/L，认为6-BA比KT更有利于火龙果的增殖。余慧琳等[36]发现，火龙果增殖培养中高浓度的6-BA易造成褐变，6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的激素组合用于增殖培养效果最好。
　　3.2 间接器官发生
　　通过间接器官发生途径构建火龙果高效的再生体系，可进行火龙果的遗传转化工作，以提高种苗质量和改良品种。有关火龙果愈伤组织诱导和分化的研究已有报道，影响间接器官发生的关键性因素是植物生长调节剂的不同种类及浓度配比。黄红梅等[25]以火龙果子叶为材料诱导愈伤组织，最适培养基是1/2 MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，子叶愈伤组织可以较容易诱导分化产生不定芽，最优培养基为1/2 MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，但是发现来自茎段的愈伤组织是非胚性愈伤组织，未能分化出不定芽。邓仁菊[37]以春季萌发的长10～20 cm火龙果枝条诱导愈伤组织效果较好，最适的愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L，暗培养7 d，再转入光照培养，愈伤组织为黄绿色、致密状，外表有颗粒状突起;愈伤组织增殖培养基以MS+TDZ0.4 mg/L+KT（或ZT）08 mg/L效果较好，增殖系数达到8以上;在愈伤组织分化过程中，添加20%～30%的椰子水对不定芽的形成具有一定的促进作用，但总体上愈伤分化率较低。邢玉良[31]以一年生火龙果幼嫩枝条为外植体，在培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.8 mg/L+NAA 01 mg/L上，愈伤组织出愈率达927%，愈伤组织块大，呈黄绿色致密细颗粒状，在培养基MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L上对愈伤组织进行不定芽诱导，不定芽再生率达87.2%，且芽呈绿色，茎段粗壮，长势健壮。彭思维[27]发现，在愈伤组织诱导试验中以启动培养基诱导成熟植株的幼嫩茎段获得“无菌茎段”作为外植体具有取材方便、污染率小且遗传稳定性强的优点，得到的愈伤组织在培养基MS+TDZ 04 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L上培养，丛生芽诱导率高达94.0%，芽苗呈绿色、长势好，而以子葉诱导的愈伤组织在培养过程中褐化严重。范建新[38]以培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖60 g/L诱导“紫红龙”火龙果花药愈伤组织，诱导率达37.8%，胚性愈伤组织为黄绿色、致密状，外表有颗粒状突起;愈伤组织增殖培养基以MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L效果较好，增殖系数达9.1以上;愈伤组织再分化培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L时，再分化率达36.7%;经生根和炼苗形成的完整植株用SRAP分子标记检测遗传性一致，能为火龙果基因工程育种和种苗快速繁育提供新的途径。 　　4 生根培养
　　对于生根培养基，由于低无机盐浓度有利于植物根系的生长，火龙果离体生根主要采用1/2 MS添加不同浓度的生长素来诱导。林润怡[39]以培养基1/2 MS+NAA 1.0 mg/L诱导生根，生根率达95.19%。邢玉良[31]以1/2 MS+NAA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+AC 500 mg/L为生根培养基，生根率达973%，平均每株生根数为7.1条，平均根长达10.2 cm，生根苗长势健壮。何小帆等[1]以培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.2 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂4.6 g/L诱导红心火龙果不定芽生根，生根率达100%。周传明等[40]以MS为基本培养基，附加IBA 1.5 mg /L进行培养7 d后开始生根，培养20 d生根率达96.7%。彭绿春等[19]以培养基MS+NAA 0.3 mg/L+AC 1.0 g/L进行生根培养，生根率达100%，发现添加活性炭十分有利于生根，增殖培养基附加活性炭可同步增殖和生根，在MS+6-BA 2～8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L培养基中能实现火龙果一次成苗，增殖系数最高可达3.55，生根率为100%。
　　5 炼苗移栽
　　组培苗移栽之前需要先对其进行炼苗，否则组培苗会因不适应有菌环境而容易死亡[41]。黄青峰[20]移栽前先將瓶苗移出恒温培养室，在室温及较强散射光中炼苗5 d，打开瓶盖继续炼苗2～3 d后移栽，火龙果试管苗成活率达86%以上。张领等[33]认为火龙果试管苗驯化移栽前期要保持较高的空气湿度，有利于成活。何小帆等[1]认为，红心火龙果组培苗移栽适宜基质配比为V（珍珠岩）∶V（红土）∶V（腐殖土）=1∶1∶1，其成活率达98.9%。周传明等[40]将长有2～3条根、苗高2～3 cm的火龙果试管苗移栽于菜园土和细砂中，40 d后移栽成活率均为100%，但以细砂为基质的移栽苗木生长较好，苗较高、茎段粗壮、生长旺盛，认为火龙果组培苗的移栽需要有良好的透水、透气条件。
　　6 展望
　　近年来，火龙果组织培养技术研究取得了不少进展，但也存在一些问题：一是不同学者研究得出的组培各阶段最适植物生长调节剂种类及浓度配比有差异，这可能与所取外植体的生长状态以及内源激素含量不同有关;二是火龙果组培技术的研究中大多是对单一品种进行培养基及植物生长调节剂浓度配比的研究，但火龙果品种较多，不同品种的消毒、诱导、增殖和生根的方法可能都存在差异;三是目前关于火龙果组培的报道主要集中在器官组培再生体系的建立，而在遗传改良、育种材料创制、种质保存等方面的研究较少。面对火龙果广阔的发展前景，今后可从以下4个方面展开研究，以推动火龙果产业的发展：一是通过培养条件的优化、离体再生体系的改进等，建立不同火龙果品种的组培技术体系;二是探讨火龙果组培过程中的一系列生理生化现象;三是利用组培技术进行遗传改良、种质创新，并结合基因工程技术，获取品质优、抗性好的火龙果种质;四是利用组培技术进行火龙果种质资源的长期保存，研究种质在继代过程中的遗传稳定性。
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