茯苓多糖调节2型糖尿病模型大鼠肝脏糖异生的机制研究

来源:用户上传      作者:韩思婕 潘翔 朱芊芊 张丹丹 张涵瑞 方敬贤 魏琼 刘丹 叶晓川

　　关键词茯苓多糖;2 型糖尿病;氧化应激;PI3K/Akt/FoxO1通路;糖异生
　　2 型糖尿病占糖尿病发病例数的90%以上，由2 型糖尿病导致的并发症大多与患者的高病死率有关[1-2]。目前，临床上用于治疗糖尿病的双胍类药物具有明显的副作用[3]。而中药在治病救人方面有几千年的历史，更是在防治2 型糖尿病及其并发症方面具有多靶点、多途径、个体化等不可替代的优势，因此，寻找标本兼治、副作用小、疗效稳定的中药及其有效成分治疗糖尿病是国内外研究的重点。
　　茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心的功效[4]。糖尿病属中医“消渴症”范畴，而茯苓是中医治疗消渴症的高频用药[5]。茯苓多糖为茯苓菌核中的主要成分，占菌核质量的70%～80%[6]，具有抗肿瘤、抗炎、保肝、调节免疫等多种药理作用[7]。有研究报道，茯苓多糖能通过调节肠道菌群来改善肥胖小鼠的糖脂代谢，减轻肝脏脂肪变性[8]。多项研究表明，茯苓多糖可以减轻糖尿病肾病小鼠的肾损伤[9-11]。在生理条件下，机体血糖水平通过体内葡萄糖产生和摄取间的动态平衡来维持稳定。糖异生是将一些非糖前体，如乳酸、甘油、生糖氨基酸等转变为葡萄糖的过程，肝脏糖异生是导致内源性葡萄糖生成增加的重要原因，而2 型糖尿病患者中糖异生作用异常活跃[12]。目前已有研究证明，抑制肝脏糖异生是治疗2型糖尿病的有效策略[13]。另有研究证实，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/叉头框转录因子O1（forkheadbox transcription factor O1，FoxO1）信号通路可调节肝脏糖异生[14]。本研究主要探讨茯苓多糖是否可以通过调节PI3K/Akt/FoxO1 通路，抑制糖异生关键酶――磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6- 磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）的蛋白表达，进而调节2 型糖尿病模型大鼠血糖，以期为阐明茯苓多糖发挥降血糖的作用机制提供数据支持。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　LiDE110 型凝胶成像仪购自日本Canon 公司;Spark10M型酶标仪购自瑞士Tecan 公司;Centrifuge 5810R型高速离心机购自德国Eppendorf 公司;530 活力型手持血糖仪购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司;WTM-1812D型膜分离实验设备、ST-2B-1812 型微滤膜元件、V0.2-2B-1812 型超滤膜元件均购自杭州沃腾膜工程有限公司;FD-1A-50 型冷冻干燥机购自北京博医康实验仪器有限公司;Eclipse E100 型光学显微镜、DS-U3 型成像系统均购自日本Nikon公司。
　　1.2 药材与试剂
　　茯苓药材采自湖北省英山县石头咀镇，经湖北中医药大学药学院叶晓川教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓P.cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核。盐酸二甲双胍片（批号ABU7707，规格0.5 g/片）购自中美上海施贵宝制药有限公司;链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批号301V021，规格1 g）购自北京索莱宝科技有限公司;三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肝糖原试剂盒（批号分别为20210423、20210426、20210422、20210420、20210425、20210426、20210420）均购自南京建成生物工程研究所;苏木素-伊红（HE）染液套装、RIPA 裂解液（批号分别为G1003、CR2103126）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司;TBST缓冲液（批号21128946）购自合肥白鲨生物科技有限公司;兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号分别为ab182651、ab181602）均购自英国Abcam 公司;兔抗磷酸化Akt（p-Akt）、兔抗磷酸化FoxO1（p-FoxO1）（批号分别为#4060、#9461）均购自美国CST 公司;兔抗G6Pase（批号LS-C446262）购自美国LSBio 公司;兔抗PEPCK（批号14892-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号AS1107）购自南非Aspen 公司;磷酸和氢氧化钠均为食品级;水为纯水。
　　1.3 动物
　　SPF 级SD 大鼠购自湖北省医学实验动物中心，动物许可证号为SCXK（鄂）2020-0018，动物合格证号为42000600040888。动物实验经湖北中医药大学伦理委员会批准，批准号为HUCMS202103009。大鼠饲养于（20±2）℃、相对湿度50%～70%、12 h 明暗交替环境中，自由饮水、摄食，适应性喂养5 d 后用于实验。
　　2 方法
　　2.1 茯苓多糖的制备
　　茯苓丁粉碎后经80%乙醇回流提取2 次（提取时间分别为2、1 h），滤过，取滤渣，挥干至无醇味后用氢氧化钠溶解，常温下充分搅拌后过滤。滤液用磷酸{至pH=7，沉淀用纯水洗涤数次，滤过后的洗涤液经WTM-1812D型膜分离实验设备微滤、超滤后，与上述沉淀合并，冷冻干燥后得茯苓多糖。采用苯酚-硫酸法测得茯苓多糖含量为95.60%。

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