针刺对慢性偏头痛大鼠趋化因子C-C配体2和C-X-C基序配体1的影响研究
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作者:周梦荻 孙铭声 刘一 郑宇琦 蔡定均 赵凌
摘要 目的：^察针刺对慢性偏头痛大鼠（CM）的足底机械痛阈、三叉神经脊束核尾侧亚核（Sp5C）中趋化因子C-C配体2（CCL2）、C-X-C基序配体1（CXCL1）水平的影响，为临床运用针灸治疗偏头痛提供一定依据。方法：将28只大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组、非经非穴组，每组7只。采用隔日颈背部皮下重复注射硝酸甘油（NTG）建立慢性偏头痛大鼠模型。每日对针刺组和非经非穴组进行针刺治疗，20 min/次。采用Von Frey仪器测定大鼠足底机械痛阈，采用酶联免疫吸附测定法检测各组Sp5C中CCL2、CXCL1的水平。结果：与对照组比较，模型组大鼠足底机械痛阈明显降低（P<0.01）;与模型组比较，针刺组大鼠足底机械痛阈明显升高（P<0.01）。与对照组比较，模型组的Sp5C中CCL2、CXCL1的水平升高（P<0.01）;针刺组较模型组CCL2、CXCL1的水平降低（P<0.01）。结论：针刺可以通过下调CCL2、CXCL1趋化因子的表达，从而减轻偏头痛的疼痛程度，发挥对偏头痛的治疗作用。
关键词 针刺;慢性偏头痛;足底机械痛阈;趋化因子C-C配体2;趋化因子C-X-C基序配体1
Effects of Acupuncture on Chemokines CCL2 and CXCL1 in Rats with Chronic Migraine
ZHOU Mengdi，SUN Mingsheng，LIU Yi，ZHENG Yuqi，CAI Dingjun，ZHAO Ling
（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）
Abstract Objective：To observe the effects of acupuncture on the hind paw mechanical pain threshold and chemokine receptor 2（CCL2） and chemokine（C-X-C motif） ligand 1（CXCL1） in the spinal trigeminal nucleus caudalis（Sp5C） in rats with chronic migraine（CM），so as to provide a reasonable basis for clinical application of acupuncture in the treatment of migraine.Methods：Twenty-eight rats were randomly divided into a control group，a model group，an acupuncture group，and a non-meridian and non-acupoint group，with 7 rats in each group.The rat model of CM was established by repeated subcutaneous injection of nitroglycerin（NTG） at the neck and back every other day.The acupuncture group and the non-meridian and non-acupoint group were treated with acupuncture every day for 20 min.The the hind paw mechanical pain threshold of rats was measured by Von Frey instrument.The content of CCL2 and CXCL1 in the Sp5C was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：As compared with the control group，the hind paw mechanical pain threshold of rats in the model group was significantly decreased（P<0.01）.As compared with the model group，the hind paw mechanical pain threshold of rats in the acupuncture group was significantly increased（P<0.01）.As compared with the control group，the content of CCL2 and CXCL1 in the Sp5C increased in the model group（P<0.01）.The content of CCL2 and CXCL1 in the acupuncture group was lower than that in the model group（P<0.01）.Conclusion：Acupuncture can reduce the pain degree of migraine by down-regulating the expression of chemokines CCL2 and CXCL1，thereby playing a therapeutic role in migraine.
Keywords Acupuncture; Chronic migraine; Hind paw mechanical pain threshold; CCL2; CXCL1
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中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.17.001
偏头痛是一种常见的中枢神经系统疾病，其病情特征为反复发作、一侧或双侧搏动性的头痛[1]。偏头痛根据发作频率可分为发作性偏头痛和慢性偏头痛，其中每年有大约2.5%的发作性偏头痛进展为慢性偏头痛[2]。与发作性偏头痛比较，慢性偏头痛致残率更高，并导致更多的疾病负担。目前，慢性偏头痛发展的生理学机制还不完全清楚。有证据表明炎症和三叉神经血管系统在发病中起着至关重要的作用[3]。三叉神经血管通路将伤害性信息从脑膜传递到大脑，三叉神经脊束核尾侧亚核（Spinal Trigeminal Nucleus Caudalis，Sp5C）是三叉神经血管通路传递脑膜伤害性信息的重要部位[4]。有学者认为，三叉血管中的无菌性神经源性炎症是慢性偏头痛发病的关键病理环节，中枢性炎症也被认为是慢性偏头痛的主要病因。
慢性偏头痛作为慢性疼痛的一种，受到了国内外研究的关注，有关慢性疼痛研究的一个重要进展表明，神经炎症反应是慢性疼痛产生和持续的重要因素[5]。偏头痛中的神经源性炎症主要以三叉神经释放神经肽如降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene-Related Peptide，CGRP）和P物质为特征，导致动脉血管U张、血浆蛋白外渗和肥大细胞脱粒，炎症介质或趋化因子可能参与了这一系列反应[6]。趋化因子是一类小分子蛋白，其相对分子质量约为8～14 kDa，当机体发生炎症、损伤及病原体入侵时，其表达水平增高，可以通过诱导神经炎症反应而导致神经性疼痛和炎症疼痛的发展[7]。其中，趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1），又称为趋化因子C-C配体2[Chemokine（C-C Motif） Ligand 2，CCL2]，是介导炎症反应的一种重要因子，也被认为是一种新的致痛因子[8]。有学者报道了家族性偏瘫偏头痛小鼠模型的三叉神经节中单核细胞趋化蛋白（Monocyte Chemotactic Protein-1，MCP-1）的mRNA和蛋白水平较高;并且他们还报道了偏头痛患者血浆中MCP-1水平升高[9-11]。此外，趋化因子C-X-C基序配体1[Chemokine（C-X-C Motif） Ligand 1]也在维持慢性炎症疼痛中发挥重要作用[12]。在一项研究中也发现，偏头痛患者血清中的CXCL1有明显的升高，CXCL1也是一种炎症介质以及细胞伤害性因子[13]。最新的研究也发现多种趋化因子在偏头痛动物模型中有所表达[14]。
针灸作为一种传统的非药物疗法，已被偏头痛临床实践指南作为推荐方案广泛应用于临床[15]。大量临床研究证明针刺治疗慢性偏头痛的疗效具有操作简单方便、疗效持久、无不良事件等特点[16]。目前，在国内外的研究中发现，针刺治疗偏头痛多选用少阳经穴且效果显著[17]。为进一步探究针灸治疗偏头痛的机制，本研究通过制备慢性偏头痛大鼠模型，观察针刺对Sp5C中趋化因子CCL2以及CXCL1的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量200～240 g，由成都恩斯维尔生物科技有限公司的实验动物中心提供，生产合格证号：SCXK（湘）2019-0004。大鼠在标准条件下（温度：22～25 ℃，相对湿度：45%～65%，12 h光照到黑暗周期，随意进食和饮水）被饲养在成都中医药大学实验动物中心。经过1周适应期，进行分组及造模。实验遵照科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。实验方案经成都中医药大学伦理委员会批准（伦理编号：2019-23）。
1.1.2 药物 硝酸甘油注射液（Nitroglycerin，NTG）（北京益民医药有限公司，国药准字H11020289）。
1.1.3 试剂与仪器 华佗牌一次性无菌针灸针0.18 mm×13 mm（苏州华佗医疗用品有限公司，批号：222012），电子Von Frey测痛仪（IITC Life Science Inc，美国，型号：BW-EVF2393），大鼠MCP-1酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）药盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号：JM-01506R1），大鼠CXCL1 ELISA药盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号：JM-10942R1），酶标仪（Diatek公司，型号：DR-200Bs）等。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法将大鼠随机分配为4组：对照组（Cont），模型组（NTG），针刺组（ACU），非经非穴组（Sham ACU），每组7只。参照Chen等[18]的报道：造模方式采用硝酸甘油颈背部皮下注射。以10 mg/kg的剂量在第1、3、5、7、9天，对模型组、针刺组、非经非穴组大鼠进行颈背部皮下注射。注射时间为上午，对照组以10 mg/kg的剂量颈背部皮下注射生理盐水。造模成功标准：大鼠出现频繁挠头、爬笼等偏头痛样行为学现象且大鼠足底机械痛阈明显降低[18]。
1.2.2 干预方法 对大鼠进行针刺治疗，首先抓取捆绑固定。针刺组选取双侧“率谷”（位于耳郭尖上方与顶骨结节连线的中点）、“阳陵泉”（后三里上外侧5 mm处）进行针刺干预。取穴标准参照邓春雷等主编的《实验针灸学》以及《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》[19-20]。率谷穴沿皮刺、阳陵泉直刺，进针后行小幅度捻转，予以平补平泻，频率为120次/min，持续捻转1 min后，每5分钟行针1次，留针20 min。非经非穴组取大鼠躯干上非穴点Ⅰ（髂棘上10 mm，后正中线旁开20 mm处）、非穴点Ⅱ（髂后上棘止点，肌肉丰厚处）进行针刺干预，留针20 min。模型组、对照组除捆绑固定外不做其余干预。连续干预9 d。
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1.2.3 机械痛阈值测定 采用电子Von Frey仪器，于第1天造模前2 h测定，之后在每次NTG注射造模后2 h测定。首先校准仪器误差，同时将大鼠放入悬空的网格箱中，使其适应环境5～10 min。大鼠安静后，将仪器读数归零，采用探针自下而上垂直刺激大鼠左后爪或右后爪的中央（无肉垫位置），逐渐增加压力，直至观察到大鼠出现明确的疼痛反应，如缩足、抬足、舔舐刺激部位、跳起等，为阳性反应。移开探针，仪器自动记录下数值。测定痛阈时，每只大鼠重复测量5次，然后对最接近5次测量值中位数的3个数值取平均值，得到机械痛阈值。
1.2.4 ELISA 在第9天对大鼠干预完成后，用2%的戊巴比妥钠0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取出Sp5C，放入-80 ℃冰箱保存备用。对组织进行研磨匀浆后，取上清液，严格按照ELISA药盒说明书进行测定。
1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。使用双因素方差分析（Two-way ANOVA），Bonferroni多重比较检验，对足底机械痛阈进行统计分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA），Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠足底机械痛阈比较 各组大鼠在第1天造模前，足底机械痛阈组间差异无统计学意义（P>0.05）。第3天注射NTG造模后，模型组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;针刺组痛阈下降较为缓慢。第5天注射NTG后，模型组痛阈持续降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;针刺组与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），针刺组与非经非穴组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。第7天注射NTG后，模型组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;模型组与针刺组比较差异有统计学意义（P<0.01）;刺组与非经非穴组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。在第9天最后一次注射NTG后，模型组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.001），针刺组痛阈与模型组比较持续升高（P<0.001）;针刺组与非经非穴组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。
2.2 各组大鼠Sp5C的趋化因子水平的比较 与对照组比较，模型组的Sp5C中CCL2、CXCL1水平显著升高（P<0.01，P<0.05）。针刺组的趋化因子CCL2的水平与模型组比较显著下降（P<0.01），CXCL1也呈下降趋势（P<0.05）。然而针刺组与非经非穴组之间趋化因子水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
偏头痛是一种常见的慢性神经血管性疾病，其病情具有反复发作、缠绵难愈以及致残性高的特征。三叉神经血管系统的激活及敏化是偏头痛发生的病理生理基础，其中神经源性炎症是其关键环节。硝酸甘油作为一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的供体具有很强的挥发性，NO分子小可以穿过血脑屏障[21]，可以引起颅内脑膜血管（颅内痛敏结构）持续地扩张从而诱发搏动样头痛。已有多项报道研究表明多次间隔的颈背部皮下注射NTG会导致大鼠偏头痛样行为及敏化痛觉反应[22]。本研究结果显示，采用颈背部NTG皮下注射可以成功复制慢性偏头痛模型，使偏头痛大鼠产生痛觉过敏。针刺可以改善慢性偏头痛大鼠的疼痛阈值，缓解痛觉过敏，并且可以降低大鼠Sp5C中趋化因子CCL2和CXCL1的表达水平。
在古代偏头痛就有“经久难愈之头痛”之称[23]，属于中医学“头痛”“头风”范畴。偏头痛多发于颞侧，正如《冷庐医话》所谓“头痛属少阳者，上至两角，痛在头角”，其发作部位与少阳经的循行相吻合，与少阳经关系密切。率谷穴为头部足少阳胆经腧穴，其为足少阳、足太阳交会穴，正如《玉龙歌》云：“偏正头风痛难医，丝竹金针亦可施，沿皮向后透率谷，一针两穴世间稀。”具有调和气血、活络止痛之功。阳陵泉为足少阳胆经之合穴，具有活血通络、疏调经脉的作用。在本课题组的前期临床研究中，选取了率谷和阳陵泉这2个穴位，发现针灸可降低偏头痛的频率和天数，以及疼痛的强度[24]。Liu等[25]对针刺治疗慢性偏头痛动物的报道中，也选取了阳陵泉穴。在本研究中率谷和阳陵泉都为足少阳胆经穴，率谷靠近偏头痛发作部位，起近治作用，阳陵泉位于远端，起远治作用，两穴合用对慢性偏头痛大鼠有较好的治疗作用。本实验结果显示，针刺组与非经非穴组之间的足底机械痛阈具有显著的差异，可见针刺少阳经穴对于缓解慢性偏头痛大鼠痛觉过敏具有明显优势，可显著提高大鼠的痛阈。然而，2组在趋化因子表达结果上差异无统计学意义，但从数据结果可见，针刺组对CCL2和CXCL1的下调作用优于非经非穴组，后续的实验可以扩大样本量，使得此趋向更加明显。
趋化因子是一类结构相似的小分子分泌蛋白，参与了细胞迁移、增殖、炎症等生理和病理过程[26]。已有临床研究表明，偏头痛患者血清中CCL2表达升高[27]。在动物研究中也发现，星形胶质细胞上CCL2的过表达会引起大鼠的热痛觉过敏[28]。CXCL1属于CXC趋化因子家族，CXCL1可以参与中性粒细胞的趋化和脱颗粒，并介导炎症性疼痛，爪底直接注射CXCL1可诱发机械性痛觉过敏[29]。也有研究表明CXCL1含量在偏头痛患者血清中升高[13]。近年来针刺通过趋化因子参与疼痛调节的研究受到了广泛的关注，研究表明，针刺可通过调节趋化因子表达和募集免疫细胞释放阿片肽类物质产生镇痛作用[30]。有研究表明，针灸可以抑制CCL2的表达，抑制星形胶质细胞c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）的激活而减轻神经病理性疼痛[31]。在佐剂性关节炎大鼠模型中，针刺可以调控脊髓部位CXCL1发挥镇痛作用[32]。在本研究中，NTG组大鼠的趋化因子水平明显升高，与以上研究中的结果一致;针刺降低了Sp5C中趋化因子CCL2和CXCL1的表达水平，表明了针刺少阳经穴可以通过抑制趋化因子从而发挥对慢性偏头痛大鼠的镇痛作用。
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本验研究了针刺对慢性偏头痛大鼠趋化因子的影响，为针刺治疗偏头痛的分子机制提供了新线索。近年来研究者们逐渐认识到，脊髓中的胶质细胞可以通过释放强效的趋化因子，介导神经元和非神经元细胞的相互作用，增强神经炎症，在神经性病理性疼痛的产生和维持中占据重要地位[33]。最新的研究也指出，趋化因子可能与偏头痛模型中星形胶质细胞或小胶质细胞的激活相关[14]。目前，胶质细胞在疼痛研究领域受到极高的关注，从“趋化因子-胶质细胞”的角度，在后续实验中，应深入探求慢性偏头痛大鼠趋化因子与胶质细胞活化之间的关系，进一步完善针刺在慢性偏头痛大鼠抗炎镇痛机制中所发挥的作用。
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（2022-06-22收稿 本文编辑：吴珊）
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