聚羟基脂肪酸酯高产菌株的筛选
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作者: 张松梅
摘 要：目的：探讨聚羟基脂肪酸酯产生菌的筛选方法。方法：从土壤中取样，经过尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛，筛选菌株。结果：成功地获得聚羟基脂肪酸酯生产菌并将其命名为Rhizobium sp.H2-5，其胞内产物产率为36.96%。结论：通过尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛进行聚羟基脂肪酸酯高产菌株筛选，方法准确、可靠，值得应用推广。
关键词：聚羟基脂肪酸酯；尼罗蓝；筛选
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
Ls-C50L立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备厂）；HZQ-Q 全温振荡摇床（中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；Friocell 生化培养箱（BMHIndustruments Co.）；Anke TGL-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；S-3700N扫描电子显微镜（日本日立公司）；1%的尼罗蓝溶液； 0.3%（w/v）的苏丹黑B染液、0.5%（w/v）的番红染液等。
富集培养基（g/L）[1]：醋酸钠10.0，酵母粉1.5，Na2HPO4・12H2O 3.8，KH2PO42.65，MgSO4・7H2O 0.2，CaC12 0.05，FeC130.01，ZnSO40.01；筛选培养基：含琼脂2%，尼罗蓝浓度为50μg/mL的富集培养基。
1.2 方法
1.2.1 初筛[2]
取溶于水的土壤样品上层液1.0mL，接于10.0mL富集培养液中32℃富集培养24h，反复传代培养至获得纯培养菌株。取富集培养液对灭菌后筛选培养基进行梯度稀释，然后涂布到初筛培养基上。初筛培养基32℃恒温条件下倒置培养48h，在波长365nm紫外灯下观察，标记并挑取发荧光的单菌落保存。
1.2.2 复筛
纯培养菌株摇床培养48h后，离心分离弃上清液，挑取离心后得到的菌体涂片、干燥、固定，苏丹黑B染液染色15min，洗脱至无色，再用番红染液复染2min，水洗，镜检观察是否有蓝黑色的脂肪颗粒[3]。
1.2.3 PHA提取
取复筛后的菌株摇床培养，收集、离心发酵液，收集菌体并烘干至恒重，称量得干菌体重量（CDW/g）。加入氯仿超声提取，向提取液中加入50ml甲醇水溶液析出白色絮状固体PHA[4]，抽滤分离出PHA，再次烘干至恒重，称量得PHA提取量。
1.2.4 鉴定
制涂片进行革兰氏染色以及芽孢染色，显微镜下观察菌体大小、形态以及有无芽孢生成。
2 结果
2.1 初筛
菌落呈现黄绿色，黄色和橙色荧光色。根据荧光色的差异分得11株纯培养物，接种至斜面培养基上，4℃低温保存。
2.2 复筛
菌体外围泛红，菌体内部可见明显的蓝黑色颗粒的菌株可能是产生 PHA的细菌。
2.3 胞内产物提取率
根据PHA提取率（%）=Wp：Wc=（PHA 提取量/CDW）×100%[5]计算各产物的提取率。菌株H2-5的胞内产物产率最高，达到 36.96%。其次为H2-2，提取率为27.32%，具体结果见表1。
2.4 鉴定结果
菌株H2-5的菌落呈圆形，表面光滑，大小均一，边缘整齐，菌落潮湿呈淡黄色，半透明。革兰氏染色结果表明菌株 H2-5 为革兰氏阴性菌，菌体形状为杆状，无荚膜，不形成芽孢。
3 结束语
聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是可以由很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要作为细胞内碳源贮藏性物质而存在，因而具有广泛应用的价值[6]。本研究采用尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛进行聚羟基脂肪酸酯高产菌株筛选，扩大了菌株资源，并获得一株新菌株，为进一步开发PHA的应用奠定基础。此外，我们还对菌株H2-5进行了生理生化实验、并绘制生长曲线。结果与文献[7]所述一致，均表明菌株H2-5不能水解利用淀粉作为碳源，也不能利用柠檬酸盐，且适应期短，生长快速，接种18h左右就可达到稳定状态。对提取菌株H2-5基因组DNA进行16S rDNA 基因扩增测序，结果表明H2-5为根瘤菌属。
参考文献
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[3]Ganduri V，Ghosh S，Patnaik P. Mixing control as a device to increase PHB production in batch fermentations with cocultures of Lactobacillus delbrueckii and Ralstonia eutropha[J].Process Biochemistry，2005，40： 257-264.
[4]堵国成，陈坚.真养产碱杆菌积累聚-β-羟基丁酸发酵条件的研究[J].生物工程学报，2000，16（1）：103-107.
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[6]Mooibroek H，Oosterhuis N，Giuseppin M，et al. Assessment of technological options and economical feasibility for cyanophycin biopolymer and high-value amino acid production[J].Applied microbiology and biotechnology，2007，77（2）： 257-267.
[7]Klemm D，Heublein B，Fink HP，et al. Cellulose： fascinating biopolymer and sustainable raw material[J].Angewandte Chemie International Edition，2005，44（22）：3358-3393.
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