鬼针草化学成分研究

来源:用户上传      作者: 王晓宇 陈冠儒 邓子云 赵杰 葛金芳 李宁 陈飞虎

　　[收稿日期] 2013-10-17
　　[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX0912-386）
　　[通信作者] *陈飞虎，Tel：（0551）65161116，E-mail：cfhchina@sohu.com；*李宁，Tel：（0551）65161115，E-mail：ln0110@sina.com
　　[作者简介] 王晓宇，硕士研究生，Tel：13739250818，E-mail：wxy891017@163.com
　　[摘要] 对鬼针草Bidens bipinnata中的化学成分进行研究，筛选具有抗肝纤维化活性单体。采用大孔树脂、硅胶、MCI树脂、Sephadex LH-20等方法进行分离纯化，得到15个化合物，并运用波谱技术测试，鉴定其结构为槲皮素（1），槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（2），紫云英苷（3），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4），5，3′-二羟基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黄酮（5），7，8，3′，4′-四羟基二氢黄酮（6），（R/S）-异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷（7），（R/S）-异奥卡宁-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（8），6，7，3′，4′-四羟基橙酮（9），海生菊苷（10），6，7-二羟基香豆素（11），3-咖啡酸酰基-2-甲基-D-赤藓糖酸-1，4内酯（12），（7S，8R）苯并二氢呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（13），丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖-（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（14），（+）丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（15）。其中化合物8，13～15为首次从本属植物中分离得到。在初步的活性筛选中化合物1，6有较强体外抑制肝星状细胞增殖的能力；化合物1，2，6，7有较强体外抑制腹腔巨噬细胞分泌炎症因子的能力。
　　[关键词] 鬼针草；化学成分；抗肝纤维化；肝星状细胞；巨噬细胞
　　鬼针草Bidens bipinnata L.是菊科鬼针草属一年生草本植物，在我国大部分地区均有分布。民间药用历史悠久，具有有清热解毒、凉血止血、散瘀、消肿等功效，主治感冒发热、咽喉肿痛、肝炎及蛇虫咬伤等。目前，各国学者对鬼针草属植物的化学成分进行广泛研究，其中主要包括黄酮类，聚乙炔类等成分。此外，本课题组前期药理学研究也表明，鬼针草具有抗肝纤维化的功效，其总黄酮提取物对于小鼠肝损伤以及大鼠肝纤维化均有保护作用[1-3]。为了更大程度的利用鬼针草药材，得到具有抗肝纤维化活性的具体成分，本实验对鬼针草总黄酮提取物化学成分进行系统分离，并且将得到的化合物进行体外抗肝星状细胞增殖以及抑制腹腔巨噬细胞生成肿瘤坏死因子TNF-α和 IL-1的活性研究，为进一步开发利用鬼针草提供依据。
　　1 材料
　　AM-400，DRX-500型核磁共振光谱仪（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作为内标）；Agilent 1260-6224液质联用仪（美国安捷伦公司）；HPD 100大孔树脂（河北宝恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences公司）；MCI（日本Mitsubishi Chemical公司）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；薄层色谱GF254硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）；肝星状细胞HSC-T6（中南大学湘雅医学院）；小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7（中国科学院上海细胞研究所）；LPS（美国Sigma）；Elisa试剂盒（美国R&D公司）；DMEM和FBS（美国Hyclone）。鬼针草采集于安徽省绩溪县，经安徽医科大学药学院中药学教研室张群林教授鉴定，属于菊科鬼针草属鬼针草B. bpinnata，标本号为JX053。
　　2 方法
　　2.1 提取分离 55 kg鬼针草干燥全草，用70%乙醇提取2次，提取液蒸发至无醇味，过HPD 100大孔树脂，分别用3倍柱体积双蒸水和70%乙醇作为洗脱剂，收集70%乙醇洗脱部分，蒸干，得到浸膏1.8 kg。浸膏用水分散，再次过HPD 100大孔树脂，采用10%～100%乙醇进行洗脱，共得到5个部分，B1～B5。B3（280 g）部分用硅胶柱色谱（氯仿-甲醇 10∶1～1∶1）梯度洗脱得到7个部分，B3-1～B3-7。B3-1 经过Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脱、硅胶色谱（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶1）梯度洗脱得到化合物11（6 mg），12（10 mg）。B3-2经过Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脱得到B3-2-1～B3-2-6；B3-2-1采用Sephadex LH-20（100%乙醇）得到化合物6（55 mg）；B3-2-6经过MCI（30%～100%甲醇）得到化合物15（54 mg）。B3-4经过Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脱得到B3-4-1和B3-4-8；B3-4-1采用硅胶柱色谱（氯仿-甲醇 5∶1～1∶1）分离纯化，得到化合物8（10 mg），13（25 mg）；B3-4-5 采用硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶5）进行梯度洗脱得到化合物4（8 mg）。B3-6采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脱得到B3-6-1～B3-6-7；B3-6-1采用凝胶（100%乙醇）纯化得到化合物14（100 mg）；B3-6-2和B3-6-7均采用MCI（0～100%甲醇）分别得到化合物7（27 mg），9（23 mg）。B3-6-4采用MCI（0～100%甲醇）以及反复的硅胶柱色谱（氯仿-甲醇 20∶1～4∶1）纯化得到化合物2（25 mg）。B3-7采用硅胶柱色谱（氯仿-甲醇 20∶1～1∶1）得到B3-7-1～B3-7-10；B3-7-1采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脱得到化合物1（45 mg）；B3-7-3先后采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）以及MCI（30%～100%甲醇）得到化合物3（20 mg），5（17 mg），10（23 mg）。 　　2.2 四甲基偶氮唑法（MTT） HSC-T6细胞培养于10% FBS的DMEM培养基。取对数生长期的细胞（5×103细胞/孔）接种于96孔板中，待细胞贴壁加入不同浓度化合物（200，100，50，25，12.5 μmol・L-1），每个剂量设5个复孔，培养48 h后弃去上清。每孔加入20 μL浓度为5 g・L-1的MTT和180 mL无血清培养基，继续培养4 h后弃上清。加入150 mL的DMSO，震荡后用酶标仪在波长490 nm测吸光度，重复3次。
　　2.3 IL-1和TNF-α含量测定 RAW264.7细胞培养于10% FBS的DMEM培养基中。取对数生长期的细胞（1×105细胞/孔）接种于24孔板中，培育养2 h后用分别加入LPS（1 mg・L-1）和不同浓度化合物（100，10，1 μmol・L-1）继续培养24 h。收集培养液的上清液于4 ℃，3 000 r・min-1离心10 min，-20 ℃保存待测。IL-1和TNF-α含量测定按ELISA试剂盒给定的步骤进行操作。
　　3 结构鉴定
　　化合物1 淡黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.034 5[M-H]-（C15H9O7，计算值301.035 4）； 1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.69（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6′），6.99（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.52（1H，d，J=1.6 Hz，H-8），6.26（1H，d，J=1.6 Hz，H-6）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：146.9（C-2），136.7（C-3），176.5（C-4），157.8（C-5），99.2（C-6），165.1（C-7），94.5（C-8），162.3（C-9），104.1（C-10），123.7（C-1′），115.8（C-2′），145.9（C-3′），148.4（C-4′），116.3（C-5′），121.5（C-6′）。以上数据与文献[4]报道槲皮素的数据基本一致。
　　化合物2 淡黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+ （C21H20NaO11，计算值471.089 8）； 1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.33（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.30（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.36（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），5.35（1H，br s，H-1″），4.22～3.69（4H，m，H-2″～5″），0.93（3H，d，J=6.6 Hz，H-6″）。以上数据数据与文献[5]报道槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的数据基本一致。
　　化合物3 淡黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+（C21H20NaO11，计算值471.089 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.04（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.88（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.46（1H，d，J=7.3 Hz，H-1″），3.57（1H，d，J=11.4 Hz，H-6″a），3.33（1H，m，H-6″b），3.41～3.09（4H，m，H-2″～5″）。以上数据与文献[6]报道紫云英苷的数据基本一致。
　　化合物4 淡黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 455.094 9[M+Na]+（C21H20NaO10，计算值471.094 9）； 1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.86（2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），7.02（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.47（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.54（1H，d，J=1.2 Hz，H-1″），4.22～2.20（4H，m，rha-H），0.90（3H，d，J=5.7 Hz，6″-CH3）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：158.0（C-2），135.7（C-3），179.3（C-4），163.2（C-5），99.6（C-6），165.0（C-7），94.6（C-8），160.9（C-9），105.8（C-10），122.6（C-1′），131.7（C-2′，6′），116.3（C-3′，5′），158.5（C-4′），102.7（C-1″），71.5（C-2″），72.2（C-3″），73.0（C-4″），71.4（C-5″），17.8（C-6″）。以上数据与文献[7]报道山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的数据基本一致。
　　化合物5 黄色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.55（1H，d，J=7.4，2.0 Hz，H-6′），7.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.08（1H，d，J=7.4 Hz，H-5′），6.95（1H，s，H-8），5.13（1H，d，J=7.12 Hz，H-1″），3.86（3H，s，4′-OMe），3.80（3H，s，3-OMe），3.77（3H，s，6-OMe），3.74（1H，m，H-6″a），3.51（1H，m，H-6″b），3.49（1H，m，H-5″），3.36（2H，m，H-2″，3″），3.23（1H，m，H-4″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：178.6（C-4），156.7（C-2），156.2（C-7），152.3（C-5），151.5（C-9），150.6（C-4′），146.5（C-3′），138.2（C-3），132.4（C-6），122.4（C-1′），120.8（C-6′），115.3（C-2′），112.0（C-5′），106.5（C-10），100.3（C-1″），94.3（C-8），77.4（C-3″），76.9（C-5″），73.4（C-2″），69.8（C-4″），60.9（C-6″），60.6（4′-OMe），60.0（3-OMe），55.9（6-OMe）。以上数据与文献[8]报道5，3′-二羟基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黄酮数据基本一致。 　　化合物6 黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 311.052 2[M+Na]+（C15H12NaO6，计算值311.052 6）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.17（1H，d，J=8.6 Hz，H-6′），6.94（1H，s，H-2′），6.80（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.75（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.52（1H，d，J=8.6 Hz，H-6），5.38（1H，dd，J=11.8，2.8 Hz，H-2），3.03（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3），2.68（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.2（C-2），43.5（C-3），190.7（C-4），117.4（C-5），109.7（C-6），152.5（C-7），132.9（C-8），151.2（C-9），114.5（C-10），130.2（C-1′），114.4（C-2′），145.2（C-3′），145.6（C-4′），115.3（C-5′），118.0（C-6′）。以上数据与文献[9]报道7，8，3′，4′-四羟基二氢黄酮的数据基本一致。
　　化合物7 白色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 473.105 1[M+Na]+（C21H22NaO11，计算值473.105 4）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.23（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），6.92（1H，s，H-2′），6.86（1H，d，J=8.9 Hz，H-6），6.77（1H，s，H-6′），6.75（1H，s，H-5′），5.39（1H，dd，J=12.4，3.2 Hz，H-2），3.71（1H，d，J=8.0 Hz，H-6″a），3.48（1H，m，H-6″b），3.40～3.16（4H，H-2″～5″），3.11（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3a），2.69（1H，dd，J=17.0，2.8 Hz，H-3b）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.3（C-2），43.5（C-3），191.2（C-4），118.0（C-5），109.0（C-6），150.5（C-7），135.2（C-8），150.8（C-9），116.6（C-10），129.9（C-1′），114.5（C-2′），145.7（C-3′），145.2（C-4′），115.3（C-5′），116.4（C-6′），101.5（C-1″），73.2（C-2″），75.7（C-3″），69.7（C-4″），77.3（C-5″），60.7（C-6″）。核磁谱图显示为一组同分异构体，以上数据与文献[10]中报道异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷的数据基本一致，且异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷仅有一个2位碳为手性中心，因此可确定该组化合物结构为异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（7a），异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖（2S）（7b）。
　　化合物8 白色粉末；1H-NMR（CD3COCD3，300 MHz）δ：7.58（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.1（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=4.4 Hz，H-5′），6.62（1H，d，J=8.7 Hz，H-6），5.55（1H，dd，J=12.9，2.9 Hz，H-2），4.78（1H，dd，J=7.3 Hz，H-1″），3.91（1H，d，J=3.0 Hz，H-OMe），3.58（1H，m，H-6″a），3.46（1H，m，H-6″b），3.34～3.14（4H，H-2″～ 5″），3.05（1H，m，H-3a），2.77（1H，m，H-3b）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：81.1（C-2），44.7（C-3），190.7（C-4），124.6（C-5），111.1（C-6），156.5（C-7），134.0（C-8），157.9（C-9），115.8（C-10），131.5（C-1′），111.3（C-2′），147.8（C-3′），148.5（C-4′），116.1（C-5′），120.2（C-6′），107.0（C-1″），75.0（C-2″），77.4（C-3″），71.0（C-4″），78.1（C-5″），62.4（C-6″），56.5（3′-OCH3）。核磁谱图显示为一组同分异构体，以上数据数据与文献[11]报道异奥卡宁-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷的数据基本一致，且异奥卡宁-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷只有一个2位碳为手性中心，因此可确定此组化合物结构为异奥卡宁-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8a），异奥卡宁-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8b）。
　　化合物9 橘红色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.037 4[M-H]-（C15H9O7，计算值301.035 4）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.45（1H，s，H-2′），7.37（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），7.11（1H，d，J=8.1 Hz，H-4），6.85（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.73（1H，d，J=8.3 Hz，H-5），6.61（1H，s，H-10）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.9（C-2），182.0（C-3），116.0（C-4），111.8（C-5），155.0（C-6），130.2（C-7），154.4（C-8），114.5（C-9），112.7（C-10），123.6（C-1′），118.4（C-2′），145.5（C-3′），148.0（C-4′），115.2（C-5′），124.6（C-6′）。以上数据与文献[12]报道6，7，3′，4′-四羟基橙酮的数据基本一致。 　　化合物10 红色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.34（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），7.18（1H，d，J=8.5 Hz，H-4），7.07（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.87（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.71（1H，s，H-10），4.94（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），3.72（1H，dd，J=10.7，4.3 Hz，H-6″a），3.49（1H，dt，J=11.8，5.9 Hz，H-6″b），3.40（1H，m，H-2″），3.40（1H，m，H-3″），3.32（1H，m，H-5″），3.21（1H，m，H-4″）。以上数据与文献[10]报道海生菊苷的数据基本一致。
　　化合物11 黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 201.015 4[M+Na]+（C9H6NaO4，计算值201.015 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.84（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.68（1H，s，H-8），6.12（1H，d，J=9.4 Hz，H-3）。以上数据与文献[13]报道6，7-二羟基香豆素的数据基本一致。
　　化合物12 白色粉末；1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.63（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.16（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），7.04（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6），6.87（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.32（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），5.34（1H，dd，J=4.2，0.8 Hz，H-3′），4.65（1H，dd，J=11.1，4.2 Hz，H-4a），4.32（1H，dd，J=11.1，0.8 Hz，H-4b），1.52（3H，s，5′-CH3）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：127.4（C-1），116.4（C-2），146.3（C-3），149.0（C-4），115.2（C-5），122.8（C-6），146.9（C-7），114.8（C-8），177.5（C-1′），73.1（C-2′），75.4（C-3′），70.2（C-4′），22.4（C-5′），166.5（CO）。以上数据与文献[14]报道3-咖啡酸酰基-2-甲基-D-赤藓糖酸-1，4内酯的数据基本一致。
　　化合物 13 黄色粉末；[α]20D -16（c 0.05，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 541.167 7[M+Na]+（C26H30NaO11，计算值541.168 0）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：9.60（1H，d，J=7.8 Hz， H-9′），7.65（1H，d，J=15.7 Hz，H-7′），7.32（1H，s，H-2′），7.31（1H，s，H-6′），7.11（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.86（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6），6.72（1H，dd，J=15.7，7.8 Hz，H-8′），5.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），4.89（1H，d，J=7.4 Hz，H-1″），3.85（3H，s，3′-OMe），3.85～3.76（2H，m，H-9），3.75（3H，s，3-OCH3），3.68（1H，m，H-6″a），3.52（1H，d，J=6.0 Hz，H-8），3.43（1H，m，H-6″b），3.30～3.17（4H，m，H-2″～5″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：134.7（C-1），110.5（C-2），149.0（C-3），146.4（C-4），115.4（C-5），118.20（C-6），87.8（C-7），52.7（C-8），62.7（C-9），127.9（C-1′），112.7（C-2′），144.2（C-3′），150.7（C-4′），130.0（C-5′），119.0（C-6′），154.0（C-7′），126.2（C-8′），194.1（C-9′），100.0（C-1″），73.2（C-2″），76.9（C-3″），69.7（C-4″），77.0（C-5″），60.7（C-6″），55.8（5-OCH3），55.9（5′-OCH3）。并利用1H-1H COSY，HSQC和HMBC进行碳氢信号归属。以上数据与文献[15]报道（7S，8R）苯并二氢呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的数据基本一致。
　　化合物14 黄色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 481.168 0[M+Na]+（C21H20NaO11，计算值471.089 8）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.00（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），6.79（1H，d，J=1.6 Hz，H-3），6.69（1H，dd，J=8.3，1.6 Hz，H-5），5.94（1H，ddt，J=16.3，9.5，6.5 Hz，H-8），5.09（1H，d，J=1.6 Hz，H-9a），5.04（1H，d，J=1.6 Hz，H-9b），4.81（1H，d，J=3.0 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=7.4 Hz，H-1′），3.87（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″a），3.85（1H，d，J=11.2，H-6′a），3.74（3H，s，2-OCH3），3.73（1H，m，H-2″），3.58（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″b），3.45（1H，m，H-5′），3.41（1H，d，J=11.2 Hz，H-6′b），3.34（1H，m，H-5″），3.31（2H，m，H-7），3.25（1H，m，H-3′），3.24（1H，m，H-2′），3.08（1H，s，H-4′）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.0（C-1），149.0（C-2），115.7（C-3），133.5（C-4），120.5（C-5），113.0（C-6），39.2（C-7），137.9（C-8），115.5（C-9），100.5（C-1′），73.2（C-2′），76.8（C-3′），70.0（C-4′），75.5（C-5′），67.7（C-6′），109.3（C-1″），75.9（C-2″），78.7（C-3″），73.3（C-4″），63.1（C-5″），55.7（2-OCH3）。以上数据与文献[16]报道丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的数据基本一致。 　　化合物15 白色粉末；[α]20D -38.5（c 0.1，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 603.204 8[M+Na]+（C28H36NaO13，计算值603.204 8）； 1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：6.72（ 2H，s，H-2，6 ），6.66（2H，s，H-2′，6′ ），4.85（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.77（1H，d，J=4.0 Hz，H-7），4.71（1H，d，J=4.0 Hz，H-7′），4.27（2H，m，H-9a，9′a），4.10（1H，d，J=7.1 Hz，H-1″），3.91（2H，d，J=9.4 Hz，H-9b，9′b），3.86（6H，s，3，3′-OCH3），3.85（6H，s，5，5′-OCH3），3.13（2H，m，H-8，8′）； 13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：136.9（C-1），106.8（C-2，6），155.9（C-3，5），140.9（C-4），89.1（C-7），57.2（C-8），74.4（C-9，9′），135.0（C-1′），106.3（C-2′，6′），150.9（C-3′，5′），137.2（C-4′），88.7（C-7′），57.0（C-8′），106.0（C-1″），77.2（C-2″），79.3（C-3″），72.8（C-4″），79.9（C-5″），64.1（C-6″），58.6（-OCH3），58.3（-OCH3）。以上数据与文献[17]报道（+）-丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的数据基本一致。
　　4 药理活性筛选
　　4.1 化合物对HSC-T6增殖的影响 利用MTT法测试分离得到的10个黄酮类化合物抑制HSC-T6细胞增殖的能力，比较各黄酮化合物的IC50，其中表没食子儿茶素儿茶酸脂（EGCG）为阳性药。结果显示化合物1～4，6，7有一定的抑制HSC-T6细胞增殖的能力（表1）。其中槲皮素（1）和7，8，3′，4′-四羟基二氢黄酮（6）的抑制活性与阳性药EGCG（43.52 μmol・L-1）相当。
　　4.2 黄酮类化合物对腹腔巨噬细胞分泌细胞因子含量的影响 对黄酮类化合物进行了抗炎免疫活性筛选。采用Elisa法测定LPS刺激的RAW264.7细胞培养上清中TNF-α和IL-1的含量。结果显示，10个化合物体外给药均不同程度的降低细胞TNF-α和IL-1的产生，并随浓度增高抑制率增强。其中化合物1，2，6，7抑制IL-1产生的效果最为明显（表2）。
　　5 讨论
　　在前期研究中发现，鬼针草总黄酮提取物对各种原因诱导的肝纤维化均有治疗作用。但目前鬼针草总黄酮中的化学组成仍不清楚，起到治疗肝纤维化作用的成分尚不明确。本文从传统的天然产物分离方法入手，分离得到15个化合物，其中有10个为黄酮类化合物，含量较高。在这15个化合物中8，13～15为首次在该属植物中分离得到的化合物。
　　肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化形成的中心环节，肝脏损伤时，HSC 受到各种致病因子的刺激，从静息状态转化为肌成纤维细胞并产生大量的细胞外基质（ECM）在肝脏沉积，最终导致肝纤维化的发生[18]。巨噬细胞在肝纤维化的过程中也很重要，其合成和释放的细胞因子如TNF-α和白介素1，6，8等促肝纤维化细胞因子，参与调节肝星状细胞的激活、增殖和胶原合成。本文在分离得到的化合物基础上，着重研究含量较高的黄酮类化合物在体外对HSC-T6细胞增殖以及对巨噬细胞RAW264.7释放的炎症因子的作用。
　　结果显示，3′，4′邻二羟基取代的黄酮和二氢黄酮类化合物1，2，6，7有较强的抑制HSC-T6增殖的活性，因此推测3′，4′邻二羟基为抑制肝星状细胞增殖的重要基团；化合物2和7的活性又相对弱于1和6，因此推测，黄酮类化合物3，7位的羟基可能为抑制肝星状细胞增殖的重要基团。同样，化合物1和6有较强的抑制RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子TNF-α和IL-1的能力，推测其活性可能也与3′，4′邻二羟基有关。
　　本实验从鬼针草总黄酮第Ⅲ部分中分离得到15个化合物，经过体外筛选得到2个活性较强的抗肝纤维化化合物。然而鬼针草总黄酮其余部分组分仍然未知，因此，还需要进一步的分离以及筛选抗肝纤维化的化合物，得到更多活性更强的化合物。
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