大鼠穿透性角膜移植排斥模型的建立

来源:用户上传      作者: 罗媛媛 景明 甘辉亮 高玉

　　【摘要】目的:建立大鼠穿透性角膜移植排斥动物模型，总结操作体会、技术特征，以及增加排斥率的相关因素。方法:选用远交系Wistar大鼠与SD大鼠建立角膜移植排斥动物模型，供体角膜植片靠近角膜缘取材，术后不加干预，仅予保留缝线，观察角膜移植排斥反应发生的进程。结果:异体角膜植片排斥反应在1周左右出现，排斥反应发生率100%，植片平均存活时间（9.65±0.77）d。异体、自体角膜移植共80例模型，术后出现瞳孔不圆9例，虹膜前粘连6例，白内障4例，眼内感染3例，虹膜脱出3例。结论:远交系Wistar大鼠和SD大鼠建立穿透性角膜移植排斥模型，适用于模拟人类角膜移植排斥反应进行深入的相关临床和基础研究。熟练的显微手术技巧、锐利的手术器械、充分的扩瞳及术后前房的形成是减少术后并发症的关键，而偏中心植片及保留缝线等方法可增加角膜排斥反应的发生率。
　　【关键词】角膜移植;排斥;大鼠;动物模型
　　【中图分类号】R779.65【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0003-02
　　角膜病致盲率在我国盲目流行病学调查中排名第二，仅次于白内障。目前，角膜移植是临床上治疗角膜盲唯一可靠、有效的复明手段，同时还可达到美容的效果。随着现代显微手术和角膜保存技术的发展，移植术后的免疫排斥反应已成为角膜移植失败的主要原因。尤其是植床新生血管化、角膜化学伤、大植片移植等角膜移植排斥反应的高危患者，术后排斥率高达60%以上[1]。减少或防治角膜移植术后的免疫排斥反应是提高手术成功率的关键。建立具有较好重复性、可靠性，且手术难度较低的角膜移植排斥动物模型，对于深入进行相关基础研究具有非常重要的意义。
　　目前较常用的动物模型主要有兔、小鼠和大鼠等。兔的原位角膜移植从技术上看容易成功，但其供体和受体组织相容性的差异难以控制；小鼠的原位角膜移植因相对较小的角膜而显得非常困难；由于大鼠角膜MHC抗原的表达与人类角膜相似，而原位移植的难度比小鼠低，所以大鼠角膜移植模型成为许多研究者的选择[2]。利用大鼠角膜移植排斥模型进行相关研究时，往往需要从选择大鼠品系、保留缝线和钻取植片部位等方面来保证异体移植排斥反应的发生。我们选取远交系Wistar雌性大鼠和SD雌性大鼠建立穿透性角膜移植排斥动物模型，供体角膜植片靠近角膜缘取材，术后不加干预，仅予保留缝线，排斥反应发生较早且排斥率高。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验动物:远交系Wistar雌性大鼠80只，SD雌性大鼠20只，体质量180～200g，第二军医大学实验动物中心提供。随机抽取40只Wistar大鼠进行原位自体角膜移植作为对照组；另40只Wistar大鼠右眼作为受体，SD大鼠20只，双眼作为供体，进行异体角膜移植作为实验组。
　　1.2 手术方法
　　（1）术前准备：将大鼠适应性饲养一周后，按体质量3.0ml/kg水合氯醛行腹腔注射全麻，术前10min美多丽滴眼液滴术眼2次，充分散大瞳孔，术前5min体积分数0.1地卡因滴眼液滴术眼2次。保持鼠眼处于水平位置，且呼吸道通畅。
　　（2）异体移植：用有齿眼科镊夹持术眼后部，使其处于半脱位状态。以3.5mm直径环钻靠近角膜缘半穿SD大鼠双眼角膜，深达基质层，维纳斯剪沿切缘剪取植片，放入Optisol液中备用。以3.0mm直径环钻半穿实验组Wistar大鼠右眼中心角膜，深达基质层，维纳斯剪沿切缘剪除角膜后作为植床，立即将植片用10-0尼龙线8针间断缝合于植床。前房内注入空气泡，结膜囊内涂金霉素眼膏。5-0丝线间断缝合睑缘3针，术后第一d拆除。角膜缝线保留至取材。
　　（3）自体移植：以3.0mm直径环钻半穿对照组Wistar大鼠右眼中心角膜，深达基质层，维纳斯剪沿切缘剪除角膜，旋转180°后原位缝合8针，其他处理同实验组。
　　1.3 观察指标:术后第1d拆除睑缘缝线，每日在裂隙灯下观察Wistar大鼠右眼角膜排斥反应进程，以植片混浊、水肿及新生血管等指标，参照Holland[3]方法进行评分，三项评分之和为当日排斥反应指数（RV, Rejection Value），当RV≥6即视为排斥反应发生。
　　1.4 标本制备及病理检查:实验组及对照组分别于术后第6、8、10、12d各取4只术眼眼球，剪取全部角膜组织放入10%甲醛固定，石蜡包埋，常规HE染色。
　　2 结果
　　实验组麻醉及意外死亡4只，对照组麻醉及意外死亡2只，淘汰后均进行补充，保证总样本量不变。
　　2.1 角膜植片观察（图1）:实验组：术后2～3d开始水肿混浊，6～7d开始出现新生血管，随后新生血管向角膜植片中心生长（图2），水肿混浊持续存在。角膜植片排斥反应在1周左右出现，排斥反应发生率100%，植片平均存活时间（9.65±0.77）d。
　　对照组：术后2～3d开始出现水肿混浊，6～7d水肿混浊开始逐渐消退；部分出现新生血管，均只达到植片植床交界处，缝线处最为明显，但角膜植片透明。
　　2.2 组织病理学检查:实验组（图3）：角膜植片基质及缝线处均有大量炎症细胞浸润。随排斥反应进程：植片逐渐变薄；周边及中央可见新生血管；内皮细胞减少，部分大鼠内皮细胞处附着中性粒细胞，胶原纤维排列紊乱。
　　对照组：角膜植片早期轻度水肿，基质仅有少量细胞浸润，在缝线及周边处可见炎症细胞浸润及新生血管，角膜厚度正常，细胞形态正常，胶原纤维走形规则。
　　2.3 并发症:两组共建立80例模型，术后出现瞳孔不圆9例，虹膜前粘连6例，白内障4例，眼内感染3例，虹膜脱出3例。
　　3 讨论
　　大鼠角膜直径小（约6mm）、质软且薄、前房极浅、瞳孔小、虹膜血管丰富、球形晶状体等特点，使得角膜移植难度较大，容易发生手术并发症。熟练的显微技术、锐利的手术器械和充分散大的瞳孔是提高手术质量的关键。通过本实验，总结操作体会、技术特征如下：
　　（1）严格无菌操作：大鼠抗感染力较强，术后感染的发生率不高。然而，一旦发生眼内感染，其临床表现很难与角膜排斥反应相区别，从而影响动物模型质量的判断。
　　（2）钻取植片：使用环钻钻取角膜植片通常有两种方法。一种是钻石刀穿刺法，龙胆紫标记角膜植片位置，用钻石刀穿刺后，沿标记位置剪下植片，此方法往往取得的植片不圆，使手术缝合不能达到严密。第二种为环钻穿通角膜法，即直接用换钻钻通角膜，此方法可以获得较规则的圆形角膜，但风险较大，容易造成虹膜脱出，晶体损伤，球后出血，甚至眼内容物脱出。我们在钻取植片方法上有所改良：先用环钻半穿角膜，深达基质层，动作要轻柔、缓慢，然后用维纳斯沿切缘剪取植片。此方法较钻石刀穿刺法，可得到较规则的圆形角膜植片；较环钻穿通法，则手术风险小、术后并发症少。
　　（3）充分扩瞳：大鼠虹膜血管丰富，手术中受到牵拉或刺激，极易引起出血、渗血等情况，不仅影响手术视野，增加手术难度，更会造成虹膜粘连、脱出、嵌顿等并发症。因此，术前、术中保持充分散大的瞳孔对模型的成功建立十分重要。大多数的“术中虹膜脱出”往往发生在钻取植片及缝合过程中，出现此种情况时，应暂停手术，用眼科镊将角膜轻轻提起，迅速滴美多丽散滴眼液于角膜和虹膜的空隙中，等待5～10min后虹膜可能回缩，切忌不能触碰及牵拉虹膜，以免造成严重并发症。

　　（4）避免损伤晶状体：大鼠晶状体呈球形，前房极浅，剪取植片及缝合过程极易损伤晶状体前囊膜，甚至造成晶状体脱出，严重影响手术质量。手术过程中器械尖端应尽量避免朝向晶状体面，动作要轻柔，尤其在前方穿刺时，要特别注意不能用力过猛。
　　（5）缝合技巧：实验组及对照组均间断缝合8针，为增加可比性，缝合的松紧、深浅及间距要尽量均匀一致。本实验在缝合时先用龙胆紫在植片与植床处做好标记，使对合口的位置更加精确，严密。
　　（6）术后前房冲洗及前房形成：术后行前房冲洗，将前房内杂质、血液及虹膜渗出冲洗干净，有利于术后恢复。而前房注入气泡可帮助前房的形成，是减少术后虹膜前粘连的关键步骤。注入气泡时动作要轻柔，使气饱均匀的充满前房；若气泡充至后房使虹膜前移时，要即刻放出气泡，滴扩瞳药后结束手术，大多会在术后重建前房。
　　（7）其他：手术操作应该尽量熟练、迅速、轻柔，耗时越短，角膜、虹膜、晶状体的暴露时间越短，术后并发症的发生亦可能更少。锐利的手术器械也是减少损伤，缩短耗时的保证。
　　角膜移植排斥反应模型的建立，应尽可能增加促进排斥反应发生几率的因素，以保证在进行相关研究时对排斥反应发生率的需求。本实验主要从以下三方面来增加排斥反应的发生率：（1）选取远交系Wistar和SD大鼠作为动物模型，Katima等[4]研究证明不同大鼠种系间角膜移植排斥反应出现时间变异较大，远交系的两种大鼠间发生排斥反应的时间早，发生率高。（2）保留缝线直至取材的方法可以增加角膜移植的发生率，缝线的存在可以诱导新生血管的长入及炎症细胞的浸润，从而加快、加重排斥反应的发生。（3）钻取植片时采用偏中心法，即植片靠近角膜缘，角膜缘处存在的抗原提呈细胞在排斥反应发生中可起到启动作用，能诱发T细胞介导的免疫排斥反应，是增加角膜移植排斥反应的重要因素[5-6]。
　　总之，远交系Wistar大鼠和SD大鼠建立穿透性角膜移植排斥模型，适用于模拟人类角膜移植排斥反应进行深入的相关临床和基础研究。熟练的显微手术技巧、锐利的手术器械、充分的扩瞳及术后前房的形成是减少术后并发症的关键，而偏中心植片及保留缝线等方法可增加角膜排斥反应的发生率。
　　参考文献
　　[1] 蔡剑秋，徐栩，陈长曦，等. 高危角膜移植排斥动物模型建立的评价和显微手术技巧. 中华显微外科杂志，2007，30（1）：52-54
　　[2] 陆燕，邹留河，吕岚，等. 大鼠角膜移植排斥动物模型的建立. 实验动物科学与管理，2002，19（3）：8-11
　　[3] Holland EJ, Chan CC, Wetzig RP, et al. Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model. Cornea, 1991, 10（5）: 374-380
　　[4] Katami M, Madden PW, White DJ, et al. The extent of immunological privilege of orthotopiccorneal grafts in the inbred rat. Transplantation, 1989, 48（3）:371-376
　　[5] Hamrah P, Zhang Q, Liu Y, et al. Novel characterization of MHC class II-negative population of resident corneal Langerhans cell-type dendritic cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002, 43（3）:639-646
　　[6] Niederkorn JY, Ross JR, He Y. Effect of donor Langerhans cells on corneal graft rejection. J Invest Dermatol, 1992, 99（5）:104S-106S

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