大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化

作者:未知

  【摘要】应用碱裂解法原理大量提取大肠杆菌中的质粒DNA,对质粒提取试剂盒的相关步骤进行了优化。结果显示按优化的步骤该方法提取的质粒DNA浓度高、质量好,能够符合后续酶切等常规实验的要求。
  【关键词】质粒DNA;碱裂解法;大肠杆菌
  质粒是闭合环状的DNA分子,存在于细菌、酵母菌和放线菌等生物的染色体并表达所携带的遗传信息,常被用做基因工程中的载体。在质粒中插入目的基因片段,构成重组质粒或称重组体,然后将重新构建的重组质粒经过电击法、CaCl2等化学试剂法处理转化,转入受体细菌(如大肠杆菌)中,使目的基因在受体菌中得以繁殖或表达。通过对试剂盒提取质粒的步骤中进行优化,经过DNA浓度测量发现以优化步骤提取的质粒DNA质量和纯度较对照组更好,能更好地满足后续实验要求。
  1材料与方法
  1.1材料
  1.1.1菌株与质粒
  重组质粒pVAXl-HA2-FimA/IL-15、pVAXl-HA2/IL一15由课组前期构建保存,(Escheriehia c0li,E.c0li)JMl09由遵义医学院口腔重点实验室提供。
  1.1.2主要试剂
  金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;卡那霉素购自北京索莱宝公司;DNAMarkerDL2,000购自大连TakaRa生物工程公司;DNAMarker 5000bp购自北京bi0med公司。
  1.2方法
  1.2.1质粒DNA的提取
  对照组按照康维世纪生物科技有限公司试剂盒步骤进行。
  实验组基于试剂盒步骤优化如下:
  (1)挑单菌落于带有卡那霉素的LB液体培养基中,37℃摇菌过夜,至0D600值为0.6。取150ml过夜培养的菌液,加入离心管中,12000Xg离心3分钟收集细菌。
  (2)向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer P1,使用移液器或涡旋振荡器充分混匀,悬浮细菌沉淀。
  (3)向离心管中加入12ml BufferP2,温和地上下颠倒混匀10次,使菌体充分裂解,室温放置5分钟。
  (4)向离心管中加入12ml BufferE3,立即上下颠倒混匀10次,避免產生局部沉淀。此时出现白色絮状沉淀,室温放置5分钟。12000Xg离心10分钟,用移液器去除大部分沉淀后,将上清全部倒入除内毒素过滤器中,慢慢推动推柄过滤,滤液收集在干净的50ml离心管中。
  (5)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇和0.1倍滤液体积的醋酸钠,上下倒混匀。
  (6)向己装入收集管中的处理后的吸附柱中加入2mlBufferPs,12000xg离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
  (7)将步骤5中滤液、异丙醇和醋酸钠的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。
  (8)12000Xg离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
  (9)向吸附柱中加入10ml BufferPW,12000xg离心2分钟,倒掉收集管中的废液。
  (10)重复步骤9。
  (11)将吸附柱重新放回收集管中,12000Xg离心5分钟,将吸附膜上液体离心干净,空离一次,倒掉废液,将吸附柱置于室温10分钟。
  (12)将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附膜的中间部位加入lmlEndo-freeBufferEB,室温放置10分钟,12000Xg离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中,重复离心两次。-20°C保存质粒。
  1.为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液新加入到吸附柱中,室温放置5分钟12000Xg离心5分钟,将质粒溶液收集到离心管中。 2.质粒贝数较低或>10kb时,Endo-fleeBufferEB在65-70°C水浴预热,可以增加提取效率。 1.2.2质粒DNA浓度检测
  应用超微量核酸蛋白测定仪对实验组及对照组提取的大肠杆菌质粒DNA浓度检测。 1.2.3质粒DNA的酶切实验
  重组质粒pVAXl-HA2-FimA、pVAXl-HA2-FimA/IL-15经Xho I/Nhe I双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳100v,1h,全自动凝胶成像分析系统拍照,记录结果。 2结果
  对同一培养液中的菌体,分别用上述不同的方法提取质粒,经超微量核酸蛋白测定仪进行质粒浓度检测,结果明显看到,应用优化步骤提取的质粒比较纯且浓度较高(见表1)。质粒的酶切鉴定:可见2.2kb(pVAXl-HA2-FimA, 图1)、3.2 kb(pVAXl-HA2-FimA/IL-15,图2)的基因片段,酶切效果非常理想,切出的条带大小吻合,而且没有杂带的出现,与预计相同。 3讨论
  质粒提取是基因工程的基础,所有提取质粒DNA的方法基本都包括培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA 3个步骤。目前关于质粒提取的方法主要有碱裂解法、煮沸法、牙签法等,其中运用较为广泛的是碱裂解法。染色体DNA与质粒DNA在变性和复性存在着差异,碱裂解法是基于而达到分离质粒DNA的目的。质粒提取试剂盒提取质粒是基于碱裂解法裂解细胞的基础上采用独特的硅基质膜吸附技术,高效专一的结合质粒DNA,同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤器,有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质,提取效果好,本实验对试剂盒中质粒提取步骤进行优化,获得更高效率的质粒提取率,有利于减少实验成本。
  (通讯作者;田源)
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