针灸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用

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　　[摘 要] 目的 研究针灸预处理调节内质网应激对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将45只SD大鼠随机分为四组，即：假手术组（Sham组）、模型组（I/R组）、针灸预处理组（EP组）、针灸预处理+LY294002组（EP+LY294002组）。I/R组、EP组、EP+LY294002组分别建立心肌缺血再灌注损伤模型，EP组与EP+LY294002组预先予以电针“内关穴”处理，EP+LY294002组于手术前1周皮下注射LY294002试剂。手术后1周超声心动图测定各组大鼠心功能，HE染色法观察心肌组织损伤情况，蛋白免疫印迹法测定Akt通路及内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的表达情况。结果 超声心动图结果显示，EP组左心室收缩末期压力（LVESP）、压力上升最大速率（dp/dt max）、压力上升最小速率（dp/dt min）水平均高于I/R组，左心室舒张末期压力（LVEDP）低于I/R组（均P<0.01），EP+LY294002组LVESP、dp/dt max、dp/dt min均低于EP组，LVEDP高于EP组（均P<0.01）。HE染色示，与I/R组相比，EP组心肌细胞损伤明显减轻，少量炎性细胞堆积，心肌纤维走形较规律;与EP组相比，EP+LY294002组心肌组织损伤再次出现加重。蛋白免疫印迹结果显示：与I/R组相比，EP组p-Akt表达明显增加（P<0.01），与EP组相比，EP+LY294002成功阻断p-Akt表达，内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase12表达显著回升（均P<0.01）。结论 针灸预处理可有效降低内质网应激从而发挥心肌缺血再灌注损伤的保护作用，其机制可能与Akt通路激活相关。
　　[关键词] 针灸;Akt通路;内质网应激;心肌缺血再灌注
　　中图分类号：R542;R245
　　文献标识码：A文章编号：1009-816X（2019）02-0120-04
　　doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.02.004
　　随着社会发展，我国人民饮食结构及工作环境的改变导致冠心病的发病率居高不下，心肌缺血最有效的治疗方式便是再灌注治疗，但是心肌缺血后重新血液灌注会导致心肌细胞结构破坏和功能代谢障碍从而加重临床症状，这一过程称之为心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤[1，2]。冠状动脉搭桥术（CABG）、经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）、急诊溶栓等在治疗冠心病的过程中势必会引起I/R损伤，因此如何有效抑制心肌缺血再灌注损伤已成为临床难题[3]。本研究旨在探索针灸预处理对于心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与内质网应激（ERS）相关的调节机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料：45只雄性SD大鼠购于浙江中医药大学实验动物中心，动物许可证为：SCXK（浙）2016—0065，平均体质量（250.08±30.11）g，饲养于SPF动物房，充足食水喂养;Akt、GRP78、CHOP、Caspase12抗体均购自CST公司，羊抗兔二抗购自谷歌生物公司，Akt通路抑制剂LY294002试剂购自Sigma公司。45只SD大鼠随机分为4组，即假手术组（Sham组）9只、模型组（I/R组）12只、针灸预处理组（EP组）12只、针灸预处理+LY294002组（EP+LY294002组）12只。
　　1.2 方法：（1）Sham组：仅进行开胸手术，穿线但不结扎左心房（LA）动脉，开胸1.5h后关闭胸腔;（2）I/R组：建立心肌I/R损伤模型;（3）EP组：于手术前2周进行电针大鼠“内关穴”处理，进针深度0.4～0.6cm，电流设定为0.1Ma，频率设定为1赫兹，隔日1次，每次针灸15min，共针灸7天。（4）EP+LY294002组：在针灸“内关穴”基础上，于手术前1周予以皮下注射LY294002溶液，剂量为4mg/kg每天，连续注射7天。
　　1.2.1 心肌I/R损伤模型的建立：参照Dhalla等[4]的方法建立大鼠心肌I/R损伤模型，戊巴比妥钠（80mg/mL）腹腔注射，待大鼠翻转反射消失后固定于手术台面，予气管插管后连接大鼠呼吸机（SAR-830），正压通气，每分钟频率60次，心前区备皮，于胸骨左缘1cm处做一纵行切口，依次分离皮下筋膜及肌肉组织，定位第4肋间，有齿镊提拉心包膜，组织剪做一小切口，钝性分离，充分暴露心脏，定位于肺动脉圆锥与左心耳之间，左心耳往下2～3cm处穿线结扎冠状动脉，血流阻断30min后松开结扎线，予血流再灌注1小时，I/R损伤模型的建立以心电图结果判断：ST段弓背向上抬高0.5mv定义为心肌缺血，再灌注后抬高的ST段至少下降一半，伴有病理性Q波或心律失常出现。I/R损伤建立后逐层缝合关闭胸腔，术后予肌注青霉素100万单位预防性抗感染，手术中死亡大鼠剔除实验，手术后继续常规
　　无特定病原体（SPF）级动物房喂养1周后行超声心动图检查，而后处死各组大鼠，提取心脏组织进一步检测相关指标。
　　1.2.2 HE染色：大鼠处死后，摘除各组大鼠心脏，冰0.9%氯化钠溶液润洗后固定于4%多聚甲醛中，组织脱水、石蜡包埋，3uM厚度组织切片，常规脱蜡，苏木精染色5～10min，自来水流动冲洗，1%盐酸乙醇中分化，自来水冲洗5min，伊红染色3min，冲洗后于梯度乙醇脱水，中性树胶封片后于显微镜下观察拍照（奥林巴斯BX51）。
　　1.2.3 蛋白免疫印迹实验：取梗死区心肌组织，以100mg：900ul的比例加入组织裂解液，于冰上匀浆裂解，4℃，12000g/min离心15min，取上清液以BCA法测定蛋白浓度，补充裂解液调节各组样品蛋白浓度一致后加入上样缓冲液，95℃变性5min后即可用于蛋白电泳，制适宜浓度的分离胶与浓缩胶，待凝固后每组样品上样80ug蛋白，60V电泳至marker分离，100V电泳至溴芬蓝跑出后停止，制作转膜三明治夹，100V电压转膜90min，TBST洗膜后5%脱脂牛奶室温下封闭1小时，根据条带位置剪膜，分别孵育对应一抗：p-Akt（1：1000）、t-Akt（1：1000）、GRP78（1：1000）、CHOP（1：1000）、Caspase12（1：1000），4℃摇床孵育过夜后TBST洗膜，羊抗兔二抗（1：5000）室温下孵育1小时，洗膜后予以ECL化學显影，Quantity One图像分析软件计算条带灰度值。 　　1.3 統计学处理：采用SPSS 18.0版统计学软件进行分析，计量资料首先进行正态性检验，符合正态分布的数据以（x-±s）表示，两两比较采用Dunnett-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 超声心动图心功能结果分析：手术过程中I/R组大鼠死亡2只，EP组大鼠死亡1只，EP+LY294002组大鼠死亡3只，手术后2周各组大鼠心功能比较结果为：EP组LVESP、dp/dt max、dp/dt min水平均高于I/R组，LVEDP低于I/R组，差异均有统计学意义（均P<0.01）。EP+LY294002组LVESP、dp/dt max、dp/dt min均低于EP组，LVEDP高于EP组，差异均有统计学意义（均P<0.01），见表1。
　　2.2 各组大鼠心脏梗死区HE染色结果比较：I/R组大鼠梗死区心肌组织中大量炎性细胞浸润、组织损伤及细胞水肿明显;与I/R组比，EP组心肌细胞损伤明显减轻，无大片的炎性细胞堆积，心肌纤维走形较规整;与EP组比，Akt通路阻断后，EP+LY294002组心肌组织损伤再次出现加重，图1。
　　2.3 蛋白免疫印迹法分析Akt蛋白表达：与I/R组相比，EP组p-Akt表达明显增加（P<0.01），EP+LY294002组p-Akt表达显著降低，与各组相比均有统计学意义（均P<0.01），见图2。
　　2.4 蛋白免疫印迹法分析内质网应激相关蛋白表达：与Sham组比，I/R组各内质网应激蛋白GPR78、CHOP、Caspase12的相对表达量明显增高（均P<0.01），EP组相较于I/R组，各内质网应激蛋白相对表达量均出现明显降低（均P<0.01）。而EP+LY294002组相较于EP组，各内质网应激蛋白的相对表达量均出现增高（均P<0.01），见图3。
　　3 讨论
　　心肌I/R损伤通常会造成心肌组织不可逆性损伤，心肌组织结构破坏及功能代谢障碍通常较急性心肌梗死发生时更为剧烈，患者心源性猝死机率也更高，因此缓解和治疗缺血再灌注损害目前已成为临床研究热点[5，6]。
　　多种疾病的病理生理过程通常都涉及ERS，目前已知I/R损伤必然会引起心肌细胞的坏死及凋亡加重，但心肌细胞的凋亡与ERS发生的关系须进一步探讨。Nickson等[7]研究证实ERS促进剂可显著促进心肌“促凋亡蛋白Bcl-2”的转录上升，说明ERS与心肌细胞的凋亡存在正性联系。Terai等[8]实验证实心肌细胞在缺血缺氧后Caspase12与CHOP的表达明显上升，该过程证实了心肌梗死中必然伴随ERS的发生，从而引起心肌细胞凋亡;因此抑制ERS可有效减轻心肌梗死所致心肌损伤。Zhao等[9]研究证实，在心肌细胞培养液中添加脂氧素A4可抑制GRP78、CHOP因子的转录，从而减轻ERS反应对缺血缺氧后复氧的心肌细胞产生保护效应。Yu等[10]对大鼠腹腔注射曲古抑菌素后发现I/R损伤后的ERS反应明显减弱了。上述研究结果提示抑制ERS可有效缓解I/R损伤所致的心肌细胞凋亡及功能障碍，而本文实验结果也证实了这一点，即通过针灸预处理可有效降低I/R所致的内质网应激相关蛋白的指标。目前，针灸“内关穴”在改善心肌缺血及其机制已得到多方面的证实，如针灸预处理可有效减少蛋白激酶C的转录从而部分抑制心交感神经的活动[11];此外针灸预处理可促进血液中过氧化氢酶表达增加，一氧化碳释放增多从而促进血管舒张保护心肌缺血[12];电针预处理亦可调节心肌酶的转录从而对缺血心肌产生保护作用[13]。我们先前的研究进一步证实了针灸预处理可对心肌缺血后的再灌注损伤有相应的保护作用，其机制与ERS的抑制显著相关[14]，然而针灸预处理如何调控ERS的发生发展而保护I/R损伤依然尚不明确，有待我们在以后实验中进行深入探索。本研究通过超声心动图及HE染色再次证实了电针预处理可有效减轻由I/R损伤所导致的心功能损害及心肌组织损伤，当使用LY294002对Akt蛋白转录进行阻断后，针灸对I/R损伤的保护作用骤然降低，此外通过蛋白免疫印迹实验发现，Akt蛋白表达抑制后，针灸对I/R损伤所致的内质网应激蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的抑制作用也明显减弱。结合以上结果本文认为：针灸预处理抑制了I/R损伤所致的ERS的发生，该种保护作用可能与针灸预处理增加了Akt蛋白的表达相关。相关文献也应证了本文结论：Tao等[15]发现Apelin-13蛋白可有效拮抗I/R所引起的ERS心肌细胞凋亡，其中PI3K/Akt通路的活化在其中扮演了重要角色;Yuan等[16]实验建立了大鼠脑I/R损伤模型，同样的使用了LY294002后，ERS所致的脑细胞损伤加重了，说明了PI3K/Akt通路的激活在脑缺血再灌住ERS细胞损伤中也发挥了重要作用。因此，Akt信号通路的活化与ERS的抑制在不同脏器的缺血再灌注损伤中均有密切的关系。综上所述，针灸预处理可有效降低ERS发挥心肌I/R损伤的保护作用，其机制可能与Akt通路激活相关，从而为临床针灸治疗心肌I/R损伤提供了重要依据。
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　　（收稿日期：2018-11-13）
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