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HPLC测定红曲中7种核苷类成分的含量

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  [摘要] 目的 建立同时测定红曲中尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷7种核苷类成分的高效液相色谱法。 方法 采用Shiseido C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氢钾(B)二元线性梯度洗脱:0~9 min,0 %A;9~40 min,0%~8%A;流速1 mL/min;柱温30℃;检测波长254 nm;进样量20 μL。 结果 尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷分别在1.00~5.00 μg、3.08~15.35 μg、2.78~13.95 μg、9.37~46.87 μg、4.58~22.86 μg、1.06~5.29 μg、4.41~22.28 μg与其峰面积呈良好的线性关系(r ≥ 0.9995),平均加样回收率分别为99.34%、99.56%、100.18%、97.95%、98.34%、98.02%、99.28%,RSD < 2.00%。 结论 该方法重现性好、准确精密,可用于红曲中核苷类成分含量测定及质量评价。
  [关键词] 红曲;核苷;高效液相色谱;含量测定;质量控制
  [中图分类号] R151 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2019)04(c)-0101-04
  Determination of 7 nucleosides in red yeast rice by HPLC
  LI Yongsheng1 ZHANG Chunling1 YANG Yuanyuan2 CHEN Zhiyon1,3
  1.Department of Pharmacy, Honghui Hospital, Xi′an Jiaotong University of Medicine School, Shaanxi Province, Xi′an 710054, China; 2.Xi′an Institute for Food and Drug Control, Shaanxi Province, Xi′an 710054, China; 3.Institute of Chinese Materia Medica, Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Shaanxi Province, Xi′an 710003, China
  [Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of seven nucleosides of uracil, cytidine, hypoxanthine, adenine, inosine, thymidine and adenosine in red yeast rice. Methods Shiseido C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) was adopted to separate the sample at the column temperature of 25°C. Acetonitrile (A)-0.05 mol/L KH2PO4 (B) was used as the mobile phase. Gradient elution method: 0-9 min, 0% A; 9-40 min, 0%-8% A. The injection volume was 20 μL, and flow rate was 1 mL/min. The detection wavelength was 254 nm. Results Uracil, cytidine, hypoxanthine, adenine, inosine, thymidine and adenosine showed a good linear relationship with the peak area (r < 0.9995) in the range of 1.00-5.00 μg, 3.08-15.35 μg, 2.78-13.95 μg, 9.37-46.87 μg, 4.58-22.86 μg, 1.06-5.29 μg, 4.41-22.28 μg, respectively. The average recovery rates were 99.34%, 99.56%, 100.18%, 97.95%, 98.02%, 99.28%, RSD < 2.00%. Conclusion The method is reproducible and accurate, and can be used for the determination and quality evaluation of nucleotide in red yeast rice.
  [Key words] Red yeast rice; Nucleosides; High performance liquid chromatography; Content determination; Quality control
  红曲性温、味甘,具有活血化瘀、健脾消食之功效,临床主治产后恶露不净、瘀滞腹痛、食积饱胀等症[1-2]。曲霉科真菌紫色红曲菌Monascus purpureus Went的菌丝及孢子在粳米内部生长,使整个米粒变成红色,即为红曲[3]。现代药理研究[4-6]表明,红曲既能降血脂、降血压,又具有防止骨质疏松、老年痴呆,抑制Aβ40神经毒等作用。红曲中主要含有酶类、色素、Monacolin类及核苷酵素等[1]。
  红曲现有的含量测定主要以洛伐他汀为主[7-9]。核苷类物质具有广泛生理活性,参与DNA代谢过程,并具有抑制肿瘤、抗病毒等多种活性[10]。免疫细胞具有更新代谢迅速的特点,在内源性核苷酸无法满足生理需求时,通過外源性核苷酸的补充,特别是药物及膳食中的核苷酸,也可参与到机体的免疫调节中[11]。其中,肌苷对糖尿病性膀胱病具有保护作用[12];尿嘧啶和次黄嘌呤对单胺氧化酶具有抑制作用[13-14];腺苷具有舒血管降压、降低心率、镇静抗惊厥作用[15]。核苷作为一类中药的有效成分,在中药及中成药质量控制方面的研究较多[16-22]。中药具有多成分、多靶点的特性,因此单一指标性成分不能反映中药质量。2010版《中华人民共和国药典》中药质量标准将“从单指标向多指标、从指标性成分向药效成分控制”定为今后中药质量控制发展方向[23]。综合考虑现有指导方针及阶段中药质量控制模式,本研究对红曲中7个核苷类成分进行定量分析,为今后红曲质量控制提供了一定的参考依据及理论实践。   1 仪器与试药
  1.1 仪器
  JA11002B电子分析天平(0.01~1100 g)(上海精密科学仪器有限公司)、BSA224S(0.0001~220 g)和BT25S(0.00001~21 g)型分析天平(德国Sartorius公司)、智能超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent)、Avium 611VF超纯水机(德国Sartorius公司)。
  1.2 试药
  胞苷购自大连美仑生物技术有限公司(批号:150515);肌苷、尿嘧啶、胸苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、腺苷购自中国食品药品检定研究院(批号分别为:140669-201606,100469-201302、101215-201401、140661-200903、110886-201102、110879-201703)。
  检测过程中使用的试剂均为色谱纯及超纯水。
  2 方法与结果
  2.1 色谱条件
  采用RP-HPLC法,色谱柱Shiseido C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);乙腈(A)-0.05 mol/L 磷酸二氢钾(B)二元线性梯度洗脱:0~9 min,0%A;9~40 min,0%~8%A;流速1 mL/min;柱温30℃;检测波长254 nm;进样量20 μL。采用超纯水作为阴性对照溶液。见图1。
  2.2 对照品溶液制备
  分别精密称取核苷类对照品适量,加超纯水制备成尿嘧啶50 μg/mL、胞苷61.4 μg/mL、次黄嘌呤55.7 μg/mL、腺嘌呤468.7 μg/mL、肌苷114.3 μg/mL、胸苷52.9 μg/mL、腺苷111.4 μg/mL的溶液,备用。
  2.3 供试品溶液制备
  粉碎红曲,过40目筛,称取粉末3 g,精密称定,加入具塞锥形瓶中,精密加入超纯水30 mL,超声提取20 min,过滤。锥形瓶及红曲残渣用适量超纯水洗涤,过滤,合并滤液转移至50 mL容量瓶中,超纯水定容至容量瓶刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,备用。
  2.4 线性关系考察
  精密吸取尿嘧啶1 mL、胞苷2 mL、次黄嘌呤2 mL、腺嘌呤1 mL、肌苷1 mL、胸苷1 mL和腺苷2 mL对照品溶液,制备成系列混合对照品溶液,其浓度范围为尿嘧啶1.00~5.00 μg/mL、胞苷3.08~15.35 μg/mL、次黄嘌呤2.78~13.95 μg/mL、腺嘌呤9.37~46.87 μg/mL、肌苷4.58~22.86 μg/mL、胸苷1.06~5.29 μg/mL、腺苷4.41~22.28 μg/mL,精密吸取20 μL混合对照品溶液注入高效液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定。以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程。结果显示,对照品浓度在一定范围内与峰面积的线性关系良好。见表1。
  2.5 精密度试验
  精密吸取20 μL混合对照品溶液,其浓度为尿嘧啶(5.00 μg/mL)、胞苷(15.35 μg/mL)、次黄嘌呤(13.95 μg/mL)、腺嘌呤(46.87 μg/mL)、肌苷(22.86 μg/mL)、胸苷(5.29 μg/mL)和腺苷(22.28 μg/mL),及同一供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进行检测,重复6次,记录标准品混合溶液、供试品中核苷色谱峰面积。尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷对照品溶液RSD为0.61%、1.47%、1.44%、0.51%、0.61%、0.77%、0.63%;供试品溶液RSD为1.46%、1.42%、1.24%、1.49%、1.08%、1.10%、1.52%。提示仪器精密度良好。
  2.6 稳定性试验
  分别于0、2、4、6、8、10 h精密吸取20 μL同一供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进行检测,记录结果。在10 h内,供试品溶液中尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷峰面积RSD分别为1.73%、1.46%、1.16%、1.68%、1.11%、1.67%、0.89%。提示供试品溶液在10 h内稳定。
  2.7 重复性试验
  精密称取同一批次样品6份,按照“2.3”项下供试品溶液制备方法进行制备,并按照“2.1”項下色谱条件进行检测,记录结果。尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷含量RSD分别为1.33%、1.62%、1.55%、1.47%、1.87%、1.56%、1.45%,提示重复性良好。
  2.8 加样回收率
  精密称取1.5 g已知含量的红曲样品6份(批号:170205),加入一定量的核苷对照品,按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备,并按照“2.1”项下色谱条件进行检测,计算含量及加样回收率。加样回收率结果见表2。结果表明该方法准确性良好。
  2.9 红曲中7种核苷类成分含量测定
  取不同批次的红曲样品,按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备红曲供试品溶液,并按照“2.1”项下色谱条件进行检测,结果见表3。
  3 讨论
  本研究考察了Shiseido C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent TC18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,其中Shiseido C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱的分离效果及峰型最优。考察了流动相乙腈、甲醇及水、甲酸水、磷酸水的不同组合和比例,结果乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾作为流动相组合的分离度及峰型最优。本研究分别对超声提取及回流提取进行了考察,超声提取法对红曲样品的所用提取时间最短,红曲中提取出的核苷类含量高,因此本研究提取方法为超声提取法。提取溶剂的选择上,考察了不同体积比的甲醇-水系统,结果超纯水作为提取溶媒时,核苷类化合物出峰多,且红曲中所检测的核苷含量高。   本研究红曲中7种核苷(尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷)在一定浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r ≥ 0.9995),方法学考察提示该方法适用于红曲中核苷类成分检测。不同批次的红曲中的核苷类成分并不稳定,推测不同的原料来源及菌种来源对于红曲中的核苷类成分含量具有一定影响。本研究对红曲中7个核苷类成分进行定量分析,为今后红曲质量分析提供了一定的参考依据及理论实践。
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  (收稿日期:2018-06-01 本文編辑:王 蕾)
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