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HPLC法测定湿疹洗剂中苦参碱的含量

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  摘要:目的 建立HPLC法测定湿疹洗剂中苦参碱的含量。方法 采用C18柱(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为:甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(10:10:80)为流动相;流速1.0 mL/min;检测波长215nm。结果 苦参碱的线性范围为0.55~2.75μg,r=0.9997,平均回收率为99.53%,RSD=1.47%.结论 该方法简便、准确,重复性好,回收率高,可作为湿疹洗剂的质量控制方法。
  关键词:湿疹洗剂;苦参碱;HPLC
  中图分类号:R284 文献标志码:A 文章編号:1007-2349(2019)03-0068-03
  湿疹是一种可在一年四季内发生的常见疾病,可以发生在任何年龄组,其发病机制复杂,它是由内因与外因相互作用,以及浅表表皮和真皮的炎症性皮肤病引起的,多发于头部和脸部、肩部、胸部等部位。该病多为对称分布,常伴有严重瘙痒等症状,病情复杂,时间长,易复发。近年来,湿疹患者逐年增多[1]。目前尚无有效的治疗方法,中医药在湿疹治疗方面取得了一定的成效,显示出自身的优势。湿疹洗剂系临床经验方,由苦参、炒黄柏、生地、炒白术等10味中药组成的复方制剂,具有清热燥湿,祛风止痒的作用,临床上用于湿疹疥廯引起的皮肤瘙痒等病症。方中苦参为主药,具有清热燥湿、杀虫、利的功效[2],据报道,苦参水煎液和苦参碱均有显著的抗炎作用。许多临床资料证明,苦参碱的抗炎机制与其抑制磷脂酶A2(PLA2)活性有关。国内外专家已证实苦参对急慢性瘙痒模型有止痒作用。此外,氧化苦参碱注射液治疗急性和亚急性湿疹的总有效率为94%,慢性湿疹的总有效率为79%[3]。黄柏是芸香科黄檗和黄皮树的干树皮,味苦性寒,归肾、膀胱和大肠经,具有清热燥湿、泻火解毒、退热的功能。现代中药研究发现,黄柏中含有多种生物碱,主要为小檗碱,其余为黄柏碱、黄柏酮、黄柏内酯、白鲜内酯、药根碱、木兰花碱、掌叶防己碱等[4],具有抗细菌毒素、抗炎、抗高血压和利尿作用。其中小檗碱对金黄色葡萄球菌等有较强的抑制作用,而金黄色葡萄球菌是湿疹的主要细菌,在某些湿疹的发生、维持和加重中起作用[5]。黄柏中小檗碱能显著降低金黄色葡萄球菌毒素的产生,促进细菌对白细胞的吞噬作用,减少炎症的损伤[6]。因此,为了有效控制湿疹洗液的质量,确保制剂的有效性和安全性,以苦参碱作为指标成分,采用高效液相色谱法直接测定苦参碱,结果满意,特异性强,操作简便,内容报告如下。
  1 仪器与试药
  Agilent高效液相色谱仪(四元泵,DAD检测器,自动进样器),Agilent1200化学工作站;FA1104电子分析天平(上海精科天平厂)。HN1006型超声波清洗机(广州华南超声设备厂生产)。苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号::160805-200508);湿疹洗剂(系自制);水为超纯水,甲醇、乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
  2 方法
  2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent C18柱(250 mm×4.6mm,5 μm);流动相:甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(10:10:80);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:215nm;进样量10μl。在此条件下,苦参碱与其他色谱峰分离良好,理论板数以苦参碱峰计算,应不低于3000.
  2.2 对照品溶液的制备 取苦参碱对照品适量,精密称定苦参碱2.750mg,置25ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液(0.11mg/ml)[7].
  2.3 供试品溶液制备 取本洗剂,摇匀,精密吸取5 mL,加浓氨试液2 mL,用三氯甲烷50ml萃取3次,合并三氯甲烷,蒸干,残渣用甲醇溶解后转移至25 mL量瓶中,用0.45μm的微孔滤膜过滤,取续滤液即得[8]。
  2.4 阴性对照试验 按处方取缺苦参的阴性对照药,按供试品溶液制备方法,制得阴性对照溶液,进样,依法测定,结果阴性对照液在相同位置处无与苦参碱相对应的色谱峰,表明处方中其它药材和辅料不干扰苦参碱的测定。
  2.5 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液5,10,15,20,25μL进样,以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归,苦参碱的回归方程为Y=4315.3X+147,r=0.9997,表明进样量在0.55~2.75μg范围内呈良好的线性关系。
  2.6 精密度实验 精密吸取上述对照品溶液10μL,按照上述色谱条件连续进样5次,测定阿魏酸峰面积值,计算苦参碱RSD为1.52%(n=5),表明仪器精密度良好。
  2.7 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10μL,分别于0,2,4,8,24 h测定苦参碱峰面积,结果RSD为1.69%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
  2.8 重复性实验 精密称取同一批次的样品6份,按照供试品溶液制备方法得到供试品溶液,依上述色谱条件测定苦参碱的含量,其RSD为1.93%,表明本方法重复性良好。
  2.9 加样回收率实验 采用加样回收法测定,取已知含量的样品(批号:170810),精密移取5 mL,精密加入苦参碱对照品适量,制成各自的供试品溶液,依法测定,计算加样回收率。结果见表1。
  2.10 样品测定 取3批样品,分别精密移取本品5 mL,按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,10μL进样。结果见表2。
  3 讨论
  根据苦参的生质,笔者参考2010年版《中华人民共和国药典》(一部)收载的苦参原药材含量测定项下的色谱条件,采用乙腈‐无水乙醇‐3%磷酸溶液(80:10:10)[9]进行了试验,结果表明供试品中苦参碱峰与其他杂质峰达不到基线分离。笔者根据文献报道[10,11],选择了3种流动相:①乙腈-水(加水0.04%三乙胺,磷酸调pH至7.00(20:80);②乙腈-0.05%磷酸溶液(5:95);③甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(10:10:80)。经多次测试结果表明,前两种流动相所得峰形较宽,含杂质多,而采用③甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(10:10:80)为流动相所得样峰形好,干扰成分少,在此流动相条件下,峰形及分离度均良好,能满足湿疹洗剂中苦参碱的含量测定要求,故选此作为含量测定的流动相。我们研究了样品的制备方法。开始将样品溶液经水稀释过滤后,按照上述的色谱条件进样测试,结果干扰成分较多,严重影响了苦参碱等成分的分离。接下来,我们把样品用氨水碱化,目的是增加生物碱的脂溶性,然后用氯仿萃取,生物碱与其他成分分离,大大提高了纯化效果,苦参碱的分离效果较好,同时也简化了文献[12]中样品的前处理方法。
  参考文献:
  [1]韩瑞玲,周燕苓.五味消毒饮加减治疗湿疹的疗效观察[J].广东医学,2014,35(9):13149-1420.
  [2]张钟媛.苦参的化学成分和药理作用研究进展[J].云南中医中药杂志,2015,36(6):104-106.
  [3]徐国红.苦参治疗湿疹的药理作用研究[J].长春中医药大学学报,2010,26(5):781.
  [4]白静.黄柏胶囊治疗湿疹90例疗效观察[J].实用医技杂志,2008,15(27):3704-3705.
  [5]陈爱明.高玉祥.金黄色葡萄球菌与湿疹关系的探讨[J].中华皮肤科杂志,1990,25(5):297-299.
  [6]邓文祥,黄柏,沈映君.中药药理学[M].北京:人民卫生出版社,2000:218-221.
  [7]张广求,王树平,刘文,等.高效液相色谱法测定参菊洗剂中苦参碱的含量[J].中国医院用药评价与分析,2014,14(3):232-234.
  [8]刘瑞连,严建业,李顺祥,等.HPLC法同时测定冰荷洗剂中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中国药师,2014,17(8):1415-1417.
  [9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:188.
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  [11]傅小英,曹红.高效液相色谱法测定苦参碱乳膏中苦参碱的含量[J].解放军药学学报,2006,22(5):385.
  [12]陈黎,王永惠,黄良永.HPLC法测定妇安消疹洗液中苦参碱与氧化苦参碱的含量[J].中国药师,2012,15(2):217-219.
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