MiR-155对喉鳞癌细胞株Hep-2细胞增殖与侵袭能力的影响

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　　[摘要] 目的 探讨miR-155对喉鳞癌Hep-2细胞增殖与侵袭的影响。 方法 应用LipofectamineTM2000将miR-155 inhibitor和miR-155阴性对照（NC）转入Hep-2细胞，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力，Hoechst染色检测细胞凋亡情况，Transwell实验检测细胞侵袭能力，Western blot检测信号传导与转录激活因子3（STAT3）和细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）的表达水平。 结果 与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor能显著抑制肿瘤细胞增殖能力，提高肿瘤细胞凋亡率，降低细胞侵袭能力，并上调SOCS1，下调STAT3表达水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 miR-155可能通过SOCS1/STAT3信号通路促进Hep-2细胞增殖，抑制凋亡，并能提高细胞的侵袭能力，进而发挥致癌作用。
　　[关键词] miR-155;喉鳞状细胞癌;Hep-2細胞;细胞增殖;细胞侵袭
　　[中图分类号] R739.65          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）11-0048-04
　　Effect of miR-155 on proliferation and invasion of laryngeal squamous cell carcinoma cell line Hep-2
　　MA Zhichao   JIANG Bo   CAI Zhiyi   CHEN Wubing   LI Zhihai
　　Department of Otolaryngology， Taizhou Municipal Hospital in Zhejiang Province， Taizhou   318000， China
　　[Abstract] Objective To investigate the effect of miR-155 on proliferation and invasion of laryngeal squamous cell carcinoma Hep-2 cells. Methods LipofectamineTM2000 was used to transfer miR-155 inhibitor and miR-155 negative control（NC） into Hep-2 cells. Cell viability was detected by MTT assay. Apoptosis was detected by Hoechst staining. Transwell assay was used to detect cell invasion ability. Signal transducers and activators of transcription 3（STAT3） and Suppressor of cytokine signaling 1（SOCS1） expression levels were detected by Western blot. Results Compared with miR-155 NC group， miR-155 inhibitor significantly inhibited the proliferation of tumor cells， increased the apoptosis rate of tumor cells， decreased the cell invasion ability， and up-regulated SOCS1 and down-regulated the expression of STAT3. The difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion MiR-155 may promote the proliferation of Hep-2 cells， inhibit apoptosisand increase the invasive ability of cells through SOCS1/STAT3 signaling pathway， thereby promoting carcinogenesis.
　　[Key words] miR-155; Laryngeal squamous cell carcinoma; Hep-2 cells; Cell proliferation; Cell invasion
　　喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是耳鼻喉科常见的原发恶性肿瘤之一，并且近年来其发病率呈现为上升趋势。虽然LSCC已形成以手术为主、放化疗为辅的综合治疗模式，但晚期患者的5年生存率仅有51%[1-2]。因此从分子或基因水平研究LSCC相关机制及相关敏感基因以寻求基因靶点治疗已成为研究重点。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一种非编码的RNA，长度约为21～25 bp。有研究指出，miRNA在恶性肿瘤发生进展中发挥重要作用[3-6]，miR-155是近年来发现的主要热点“癌基因”之一，本课题组前期研究发现在LSCC患者病变组织中miR-155较对照组表达明显升高，并可以作为LSCC标记物及预后的独立因素。因此，本研究在此基础上，通过降低LSCC细胞株Hep-2中miR-155的表达量，探讨其对Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及可能机制，为LSCC的诊治及基础研究提供新的线索。 　　1 材料与方法
　　1.1 主要材料
　　LSCC细胞株Hep-2（中国科学院细胞库）;miR-155 inhibitor及miR-155 阴性对照（negative control，NC）（上海GenePharma公司）;LipofectamineTM2000、Trizol试剂（Invitrogen公司）;DMEM培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法（美国Gibco公司）;Hoechst33258染色试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）;24孔Transwell板（美国Corning公司），基质胶（美国BD公司）;兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase，GAPDH）单克隆抗体、细胞因子信号抑制因子1（Suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）及信号传导与转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）（Abcam公司）。
　　1.2 实验分组及细胞转染
　　本实验于2016年1月～2018年5月在浙江省台州市耳鼻咽喉科基础与临床应用重点实验室完成。实验分组：（1）miR-155抑制物转染组（miR-155 inhibitor组），转染miR-155 inhibitor;（2）空白对照组（miR-155 NC组），转染阴性对照核苷酸（miR-155 NC）;转染按LipofectamineTM2000试剂说明书操作。
　　1.3 MTT法检测细胞增殖能力
　　将转染后的Hep-2细胞接种于96孔板，分别转染12、24、36、48、60、72 h后加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续进行培养4 h，加入150 μL DMSO，震荡后，应用酶标仪在560 nm波长下检测各孔吸光度（A）值，实验重复3次。
　　1.4 Hoechst染色
　　消化收集转染后48 h的各组Hep-2细胞接种于6孔板，加入固定液4%多聚甲醛（PFA），在避光条件下以Hoechst33258试剂进行染色，染色后进行观察并拍照。
　　1.5 Transwell实验
　　将预冷、无血清培养基稀释的Matrigel基质胶铺在培养小室上;加入100 μL无血清培养基稀释的各组转染后Hep-2细胞（5×105个/mL）;于下室中加入含20%血清的DMEM培养液;37℃条件下培养48 h后，取出培养小室，用3.7%甲醇固定20 min，风干，结晶紫染色10 min;流水冲洗，拭去上室底部未侵袭细胞;在100倍光学显微镜下进行观察，每张膜随机选取10个视野，计数每个视野的细胞数量。
　　1.6 Western blot
　　消化收集转染后48 h的各组Hep-2细胞接种于6孔板，提取细胞总蛋白，凝胶电泳，转膜;一抗溶液（兔抗STAT3、SOCS1及GAPDH单克隆抗体）孵育，4℃过夜;次日在25℃条件下二抗溶液中孵育2 h;应用凝胶成像系统显色、曝光，经ImageLab Software进行各抗体条带灰度值分析。
　　1.7 统计学分析
　　应用SPSS21.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1 抑制miR-155表达对细胞增殖能力的影响
　　MTT实验结果表明，与miR-155 NC组比较，下调miR-155表达量能明显降低细胞增殖能力，差异有统计学意义（P<0.05）（封三图5）。
　　2.2 抑制miR-155表达对细胞凋亡的影响
　　miR-155 NC组Hep-2细胞经Hoechst33258染色后呈淡蓝色荧光，细胞核大小较均一，圆形或椭圆形，染色质分布均匀;miR-155 inhibitor组Hep-2出现较多的凋亡细胞，表现为亮蓝色的核固缩和核碎裂呈分叶状，其染色质凝聚，呈颗粒团状，分布不均匀。miR-155 inhibitor组可显著增加细胞凋亡率（27.32±2.62）%，与miR-155 NC组（12.16±1.53）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）（封三图6）。
　　2.3 抑制miR-155表达对细胞侵袭能力的影响
　　Transwell检测显示，miR-155 inhibitor组和miR-155 NC组的侵袭细胞数分别为（860±40）个、（1780±60）个，miR-155 inhibitor组细胞侵袭能力明显低于miR-155 NC组，差异有统计学意义（P<0.05）（封三图7）。
　　2.4抑制miR-155表达对细胞SOCS1、STAT3蛋白表达的影响
　　Western blot实验表明，抑制miR-155的表达引起SOCS1表达明显上升，而STAT3的表达量明显下降，结果有显著统计学差异（P<0.05）（表1、图1）。
　　3 讨论
　　miR-155作为miRNAs家族一员，是一种多功能microRNA，在细胞活动的重要环节，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理过程中发挥着重要作用，通过介导Fox03a、RhoA等多种靶基因表达参与炎症、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的发生发展[7-8]。已有研究表明miR-155在许多肿瘤组织中均存在异常表达，并发挥癌基因的作用。Peng等[9]发现miR-155可以通过抑制DMTF1促进膀胱癌的发生。Johansson等[10]在乳腺癌研究中发现，miR-155以TGF-β为靶分子，在上皮细胞向间质细胞转化、转移及侵袭过程中起重要作用;Huang等[11]研究表明，miR-155可以促进胰腺癌的发生发展。但目前miR-155在LSCC发病中的具体作用机制研究仍相对较少。Wang等[12]研究发现LSCC患者血浆中miR-155含量高于对照组，差异有统计学意义;本课题组前期研究发现在LSCC患者病理组织中miR-155较对照组表达明显升高，与其结果一致，并且发现miR-155可作为LSCC标记物及预后的独立因素。本研究在此基础上，将miR-155 inhibitor转染至喉癌Hep-2 细胞，下调miR-155的表达量，发现肿瘤细胞的增殖能力明显下降，而肿瘤凋亡明显增加，细胞迁移侵袭能力减弱;而王洋等[13]通过miR-155模拟物转染至Hep-2细胞中，上调miR-155的表达量，得到一致的结果，这些结果表明miR-155在LSCC的发生、发展的过程中起到原癌基因样的作用。 　　但也有一部分研究結果得出相反的结论，认为miR-155对肿瘤的增殖、凋亡和侵袭等恶性特征起抑制作用。Lei等[14]发现在宫颈癌细胞中，增加miR-155的表达量能降低肿瘤细胞侵袭转移的能力，并且增加癌细胞对化疗药物的敏感性。Li等[15]的研究表明在MKN-45胃癌细胞中，过表达的miR-155靶向作用于信号传导蛋白SMAD2抑制细胞的迁移、侵袭和粘附。这可能与miRNA的功能具有组织和细胞特异性有关，即在不同的组织细胞中miR-155通过调控不同的靶基因，激活不同的信号通路，从而发挥不同的功能。结合本研究的结果，提示miR-155在LSCC细胞Hep-2中是起到促进作用的，但其具体的调控机制仍有待进一步研究。
　　在众多参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学过程的信号通路中，STAT3是其中重要的通路之一。其广泛分布于不同的组织和细胞中。活化后的STAT3以二聚体形式进入细胞核，调节靶基因转录，发挥其各种不同的生物学效应[16-17]。Chang等[18]在结肠癌细胞中沉默STAT3表达，发现bcl-xl、survivin的表达显著下降，从而促进结肠癌细胞的凋亡。Zhu等[19]的研究发现，抑制STAT3活性可明显降低MMP-2的表达，使肿瘤侵袭性降低。最新研究表明miR-155是STAT3通路上游重要的调控基因，过度表达miR-155造成SOCS1的活性抑制，而SOCS1是STAT3的负性调控因子，SOCS1的抑制引起STAT3的过度激活，持续活化的STAT3促进肿瘤细胞的生长、增殖及侵袭和转移[20]。本研究通过转染miR-155 inhibitor，下调miR-155后，发现喉癌Hep-2细胞中SOCS1的表达量增加，而STAT3的表达量下降，表明在喉鳞癌中miR-155可能通过调控SOCS1-STAT3通路来发挥癌基因的作用。另有研究发现在CD4+PD-1+淋巴细胞中miR-155表达量明显增高，而恶性肿瘤表面的程序性死亡因子配体1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）与CD4+PD-1+淋巴细胞结合后，诱导其向Tregs细胞转化，而Tregs细胞是调节免疫应答与免疫耐受平衡的重要效应细胞，过多的Tregs细胞引起肿瘤免疫逃逸的发生;而miR-155通过抑制SOCS1，激活STAT3的信号通路，在维持Tregs细胞增殖活性及功能上具有重要作用[21-24]。本研究观察到miR-155通过SOCS1- STAT3通路影响Hep-2细胞的生物学活性，提示miR-155可能与LSCC肿瘤免疫逃逸过程相关，为下一步的研究提供重要方向。
　　综上所述，本研究表明转染miR-155 inhibitor能显著抑制Hep-2细胞增殖能力，提高肿瘤细胞凋亡率，降低细胞侵袭能力，其机制可能与SOCS1/STAT3信号通路相关。
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　　（收稿日期：2018-09-25）
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