正交试验法优化加味八珍合剂中特女贞苷的提取工艺

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　　[摘要]目的 优化加味八珍合剂中特女贞苷的提取工艺。方法 采用正交试验法，以提取液中特女贞苷的含量为考察指标，对影响水煎提取效果的煎煮前浸渍时间（A）、加水倍数（B）、提取次数（C）与提取时间（D）四项作为考察因素进行研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定加味八珍合剂中特女贞苷的含量。结果 加味八珍合剂的最佳提取工艺为A2B1C2D1，即加6倍量的水，浸渍1 h，煎煮提取3次，每次1 h。结论 该实验所优选工艺得到的出膏率和特女贞苷的提出率最高。
　　[关键词]加味八珍合剂;特女贞苷;高效液相色谱法;提取工艺;正交试验
　　[中图分类号] R282          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）3（a）-0028-04
　　Optimization of extraction process of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture by orthogonal experiment
　　ZHANG Wei   SHI Xiao-hui▲
　　Department of Pharmacy， Zhangjiagang Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province Zhangjiagang   215600， China
　　[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture. Methods The orthogonal experiment method was used to determine the content of the Specnuezhenide in the extract as the index， and the immersion time （A）， the water addition ratio （B）， the extraction times （C） and the extraction time （D） as factors which affected the extraction effect of the decoction were studied. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the content of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture. Results A2B1C2D1 was the best extraction process for Jiawei Bazhen Mixture， that was， adding 6 times of water， immersing for 1 hour， and boiling and extracting 3 times for 1 hour each time. Conclusion The preferred process for this experiment is to obtain the highest extraction rate of mixture and the highest extraction rate of Specnuezhenide.
　　[Key words] Jiawei Bazhen Mixture; Specnuezhenide; High performance liquid chromatography; Extraction process; Orthogonal experiment
　　加味八珍合劑作为南京中医药大学附属张家港医院（以下简称“我院”）的院内制剂，全方由多味中药组成，如茯苓、当归、川芎、女贞子等，具有益气血、补肝肾之效。加味八珍合剂是在八珍颗粒[1]的基础上增加了女贞子和狗脊两味中药，增强了滋肾阴、强腰膝之功效，主要用于气弱血亏、肾虚腰酸、四肢倦怠及妇女月经不调等症。方中女贞子具有扶正固本、滋补肝肾、明目乌发的功效[2]。随着当今研究的不断深入，女贞子更多的功效被挖掘出来，如在抗肿瘤、护肝[3]、延缓衰老、抗炎抗菌、调节免疫等方面都具有相应的疗效，并发现其对高血脂[4]、高血压、骨质疏松[5]等病症都有一定的效果[6]。现代药理研究表明女贞子的有效成分为特女贞苷[7]，故本研究选择特女贞苷的含量作为水提正交工艺研究的评价指标，对影响水煎提取效果的煎煮前浸渍时间、加水倍数、提取次数与提取时间4个因素进行研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定加味八珍合剂中特女贞苷的含量对加味八珍合剂水提取工艺进行优化研究，以期优选出加味八珍合剂的最佳工艺。
　　1仪器与试药
　　1.1仪器
　　Waters 2695高效液相色谱仪（沃特世公司），Waters 2998紫外检测器（沃特世公司），Empower色谱工作站;AG135型电子天平（瑞士梅特勒公司，精确度为十万分之一），AUX220电子天平（日本岛津公司，精确度为万分之一）;GZX-DH400-BS-II型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）;摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。
　　1.2试药
　　加味八珍合剂（我院自制，批号：20141208）;特女贞苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111926-201404，供含量测定用）;女贞子饮片由本院中药房提供，经我院药学部副主任余辉主任中药师进行品种和质量鉴定，鉴定结果为合格（批号：20140503，）;流动相用甲醇为色谱纯（Merck公司，德国），实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。 　　2方法与结果
　　2.1正交试验设计
　　拟以煎煮前浸渍时间（A）、加水倍数（B）、提取次数（C）与提取时间（D）四项作为考察因素[8-10]，每一因素设2个水平，按L8（27）正交表进行正交实验设计（表1），考察指标为出膏率及相同饮片用量情况下特女贞苷提出量。
　　2.2样品提取液的制备
　　按处方比例，取党参等10味药共50.45 g（共8份），按以下表2进行试验，提取液滤过后，合并，最后浓缩或稀释，定容至500 ml，备用。
　　2.3出膏率测定
　　分别精密量取“2.2项下”制备的各样品溶液10 ml于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃常压干燥5 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称重，按饮片量计算出膏率[11-13]，结果见表2。
　　2.4特女贞苷含量测定
　　2.4.1色谱条件
　　色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（40∶60），检测波长为224 nm，柱温30℃，流速为1 ml/min。
　　2.4.2对照品溶液的制备
　　精密称定特女贞苷对照品10.01 mg于10 ml量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，即得特女贞苷对照品母液，于4℃储存备用。精密量取上述特女贞苷母液1 ml于10 ml量瓶中，加流动相稀释，摇匀，定容至刻度，得浓度为0.1001 mg/ml的对照品溶液。
　　2.4.3标准曲线的制备
　　精密吸取“2.4.2项下”对照品工作液2、4、8、l0、12、15 μl进样，平行进样2次。以进样量C（μg）对峰面积平均值A进行回归处理，得回归方程：A=1 141 828.5C-75 342.2（r=0.9999）。结果表明，特女贞苷在0.2002～1.5015 μg范围内线性关系良好。
　　2.4.4特女贞苷提出量测定
　　精密吸取“2.2项下”各样品提取液1 ml，用0.45 μm滤膜压滤，取续滤液备用。精密吸取“2.4.2项下”工作液2、15 μl及上述各供试液10 μl，分别平行进进样2次。以随行标准曲线法定量，并计算指标成分特女贞苷绝对提出量，结果见表2。
　　2.4.5数据分析及结果验证
　　2.4.5.1直观分析  出膏率最佳提取工艺：A2B1C2D2（C、A为主要因素）;特女贞苷最佳提取工艺：A2B2C2D1（C、A、D为主要因素）。
　　2.4.5.2方差分析  特女贞苷出膏率、提出量方差分析结果具体见表3、表4。方差分析结果表明，对出膏率而言，C因素不同水平间有一定差异，C2>C1，其他A、B、D三因素各水平间均无显著性差异;对特女贞苷提出率而言，A、C两因素各水平间有显著性差异，A2 >A1，C2>C1，B、D两因素各水平间无显著性差异。结合大生产实际，综合考虑后，选择A2B1C2D1，即加6倍量的水，浸渍1 h，煎煮提取3次，每次1 h。
　　2.5验证试验
　　2.5.1验证样品溶液的制备
　　按处方比例，取党参等10味药共100.9 g（共2份），除煎煮次数外，严格按以上优选工艺提取（加6倍量水，煎煮提取3次，每次1 h）。每次提取液滤过后，适当浓缩，分别定容至500 ml，备用。
　　2.5.2验证特女贞苷出膏率测定
　　精密量取“3.1项下”制备的各提取液10 ml，置恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃常压干燥5 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称重，按饮片量计算出膏率及累积出膏率，结果见表5和图1、图2。
　　2.5.3验证特女贞苷提出率测定
　　用与上述相同的方法制得供试品溶液，精密吸取“2.4.2项下”工作液2、15 μl及各供试品溶液10 μl，分别平行进样2次。以随行标准曲线法定量，并按饮片量计算指标成分特女贞苷提出率及累积提出率，结果见表5和图3、图4。
　　2.5.4结论
　　由以上验证试验结果可知，按优选工艺煎煮3次后，累积出膏率为27.90%（占5次总出膏率的90.38%），特女贞苷累积提出率为0.0816%（占5次总提出率的82.16%），此时特女贞苷累积提取转移率已达71.60%。由于煎煮3次后，饮片中90%以上的固体及70%以上的特女贞苷已被提出，因此验证了上述优选工艺的科学性及可行性。
　　3讨论
　　3.1流动相的选择
　　本研究流动相分別选用乙腈-0.1%磷酸（18∶82）、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液（25∶75）、甲醇-水（40∶60）、甲醇-水（36∶64）、甲醇-水（80∶20）等条件[14-18]，经过预实验，考虑到方法简便，且实验后色谱柱易清洗，最终了选择甲醇-水（40∶60）为流动相。
　　3.2正交实验结果分析
　　中药复方制剂的提取工艺决定其疗效的高低，因此尽可能溶解和浸出有效成分，避免提取出无效成分等杂质显得尤为重要。根据预试验结果，饮片大小以1～3 cm为宜，水浸渍1 h，兼顾大生产确定以煎煮前浸渍时间、加水倍数、提取次数与提取时间为考察因素[19]。本合剂的有效成分考察指标选择女贞子中特女贞苷的含量，出膏率作为相对的质控指标。从试验结果分析，特女贞苷的含量、出膏率各自最多得量的工艺条件是一致的，提示在此工艺条件下，即加6倍量水，浸渍1 h，煎煮提取3次，每次1 h，药材有效成分的提取较完全。
　　综上所述，HPLC测定加味八珍合剂提取液中特女贞苷的含量，专属性强，操作简便，结果准确，重复性好。最佳提取工艺为加6倍量的水，浸渍1 h，煎煮提取3次，每次1 h。此提取工艺经验证科学合理，稳定可行。 　　[参考文献]
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　　（收稿日期：2019-07-25  本文编辑：任秀兰）
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