APE1基因单核苷酸多态性与肝细胞癌临床表型的相关性研究

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　　[摘要]目的 探討APE1基因-141T/G和148Asp/Glu位点单核苷酸多态性与肝细胞癌（简称“肝癌”）不同临床表型的相关性。方法 选取2018年1月1日～12月31在南通大学附属医院介入放射科住院的125例初诊肝癌患者作为研究对象，提取基因组DNA，采用panel高通量数据分析进行APE1基因分型，分析各基因型与肝癌临床表型的关联性。结果 -141位点杂合突变基因型TG的患者较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.513，95%CI：1.411～14.445，P<0.05），纯合突变基因型GG较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.444，95%CI：1.217～16.233，P<0.05），突变基因型TG+GG较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.491，95%CI：1.457～13.848，P<0.05）;148位点各基因型分期风险无明显关联（P>0.05）。-141位点杂合突变基因型TG的患者较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.091，95%CI：1.019～10.064，P<0.05），纯合突变基因型GG患者较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.789，95%CI：1.025～14.009，P<0.05），突变基因型TG+GG较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.302，95%CI：1.061～10.276，P<0.05）;148位点各基因型发生门脉侵犯的风险无明显关联（P>0.05）。-141位点各基因型发生淋巴结转移的风险无明显关联（P>0.05）;148位点纯合突变基因型GG患者较野生型TT患者发生淋巴结转移的风险增加（OR=3.500，95%CI：1.018～12.03，P<0.05）。-141位点纯合突变基因型GG的患者较野生型TT患者发生远处转移的风险增加（OR=5.667，95%CI：1.074～29.891，P<0.05）;148位点各基因型发生远处转移的风险无明显关联（P>0.05）。结论 APE1基因单核苷酸多态性与肝癌BCLC分期、门静脉侵犯、淋巴结转移、远处转移等临床表型之间存在相关性。
　　[关键词]APE1;肝细胞癌;单核苷酸多态性;临床表型
　　[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）5（a）-0013-05
　　Study on the correlation between single nucleotide polymorphisms of APE1 gene and clinical phenotype of hepatocellular carcinoma
　　LU Xiao-hua   ZHU Xiao-qing▲   YUAN Hong-xin   CHU Yu-shan
　　Department of Interventional Radiology， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu Province， Nantong   226001， China
　　[Abstract] Objective To investigate the correlation between the single nucleotide polymorphisms of APE1 gene at the locus of -141T/G and 148Asp/Glu and different clinical phenotypes of hepatocellular carcinoma. Methods A total of 125 patients newly diagnosed with hepatocellular carcinoma who were hospitalized in the Interventional Radiology Department of the Affiliated Hospital of Nantong University from January 1 to December 31， 2018 were selected as the research objects to extract genomic DNA. The panel high-throughput data analysis was adopted to conduct APE1 genotyping and the correlation between each genotype and the clinical phenotype of hepatocellular carcinoma was analyzed. Results At locus -141， patients with heterozygous mutant genotype TG had an increased risk of later stage than patients with wild-type TT （OR=4.513， 95%CI： 1.411-14.445， P<0.05）， the patients with homozygous mutant genotype GG had an increased risk of later stage than patients with wild-type TT （OR=4.444， 95%CI： 1.217-16.233， P<0.05）， and the risk of later stage in patients with mutant genotype TG+GG was higher than that in patients with wild type TT （OR=4.491， 95%CI： 1.457-13.848， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of stages of each genotype at locus 148 （P>0.05）. At locus -141， patients with heterozygous mutant genotype TG had an increased risk of portal vein invasion compared with patients with wild-type TT （OR=3.091， 95%CI： 1.019-10.064， P<0.05）， the patients with homozygous mutant genotype GG had an increased risk of portal vein invasion compared with patients with wild-type TT （OR=3.789， 95%CI： 1.025-14.009， P<0.05）， and the risk of portal vein invasion in patients who carried the mutant genotype TG+GG was higher than that in patients with wild type TT （OR=3.302， 95%CI： 1.061-10.276， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of portal vein invasion among all genotypes at locus 148 （P>0.05）. There was no significant difference in the risk of lymph node metastasis among genotypes at locus -141 （P>0.05）. At locus 148， patients with homozygous mutation GG had an increased risk of lymph node metastasis compared patients with wild-type TT （OR=3.500， 95%CI： 1.018-12.03， P<0.05）. At locus -141， patients with homozygous mutation GG had an increased risk of distant metastasis compared with patients with wild-type TT （OR=5.667， 95%CI： 1.074-29.891， P<0.05）. There was no significant difference in the risk of distant metastasis among all genotypes at locus 148 （P>0.05）. Conclusion The single nucleotide polymorphisms of APE1 gene are correlated with clinical phenotypes of hepatocellular carcinoma such as BCLC stage， portal vein invasion， lymph node metastasis and distant metastasis. 　　[Key words] APE1; Hepatocellular carcinoma; Single nucleotide polymorphism; Clinical phenotype
　　肝细胞癌，简称肝癌，是最常见的恶性肿瘤和肿瘤致死病因之一，严重威胁人们的生命健康。流行病学研究证实，遗传因素在肝癌的发病和转归中占据重要地位[1]。目前临床工作中，肝癌临床表型是制定治疗方案、判断疗效及预后的一项重要参考指标。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人类基因组中广泛存在，作为第三代遗传标记，关联疾病遗传易感性，影响疾病进程等。自1996年发现至今，其不仅已应用于流行病学预判不同疾病的罹患风险，还有望成为临床工作中评价疾病疗效及预后的重要指标[2]。已有大量关于SNP与肝癌发生及转归存在明显关联性的报道[3-9]。目前已知多数环境致癌物通过外源性和内源性DNA损伤物质与细胞DNA共价结合，引起DNA损伤，从而导致基因突变和细胞癌变，最终导致肿瘤等相关疾病的发生。作为DNA修复系统中最主要的一种修复途径，碱基切除修复（base excision repair，BER）在修复DNA损伤、维持DNA完整性中起着重要作用[10]。本研究选取BER途径中的关键基因之一，即脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶基因（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1），探寻该基因SNP与肝癌临床表型之间是否存在相关性。已有报道显示该基因SNP与多种肿瘤的易感性存在关联[5]，但针对该基因SNP与肿瘤临床表型相关性的报道不多。通过查找dbSNP数据库，笔者发现存在于APE1基因中的近20个SNP位点中，最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）>5%的SNP仅有两个，分别是启动子区-141T/G（rs1760944）和第5外顯子148Asp/Glu（rs1130409），因此选择这两个位点进行相关研究。通过分析以上两个位点多态性与肝癌临床表型[巴塞罗那分期（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）、门静脉侵犯、淋巴结转移、远处转移]的关系，以期发现该基因SNP在肝癌病情进展中所发挥的作用，从分子生物学层面为临床实际工作中制定治疗方案及判断预后带来帮助，现报道如下。
　　1资料与方法
　　1.1一般资料
　　选取2018年1月1日～12月31在南通大学附属医院介入放射科住院的125例新确诊拟行介入治疗的成年肝癌患者作为研究对象，收集入组者的临床资料，采集外周静脉血样本（EDTA抗凝管，3 ml左右）。排除标准：①非初诊肝癌患者;②体力状况评分（PS）≥3分患者。其中男100例（80.0%），女25例（20.0%）;年龄39～92岁，平均（61.20±1.21）岁;BCLC A期17例（13.6%），B期72例（57.6%），C期36例（28.8%）;有门静脉侵犯30例（24.0%），无门静脉侵犯95例（76.0%）;有淋巴结转移27例（21.6%），无淋巴结转移98例（78.4%）;有远处转移17例（13.6%），无远处转移108例（86.4%）。所有病例均依据《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》诊断标准加以确诊，其中116例符合肝癌临床诊断标准，9例符合肝癌病理学诊断标准。临床分期按照BCLC标准进行分期。所有研究对象资料的收集和血样标本的获得均符合医院医学伦理委员会的规定。
　　1.2方法
　　1.2.1主要仪器和试剂  台式离心机（Pico-21，Thermo Fisher公司）;漩涡混合器（GL-88B，其林贝尔仪器制造有限公司）;混匀型干式恒温器（TND03-H-H，Thermo Fisher公司）;电泳槽（DYCZ-21，北京市六一仪器厂）;Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（B518253，上海生工公司）;Synergy LX MULTI-Mode Microplate Reader（BioTek公司）。
　　1.2.2基因位点分型  （1）DNA抽提：使用上海生工Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃冰箱保存备用。（2）SNP分型：采用panel高通量数据分析进行基因分型。步骤如下。①使用cutadapt软件去除3′端序列adaptor，并切除reads 5′端及3′端前10个碱基;②使用prinseq-lite软件去除平均质量值<20的序列;③用bwa软件将reads1及reads2采用pair-end mapping方式比对到靶区域序列中;④做SNP及Indel calling，采用的软件为自写perl脚本，对reads1及reads2上的序列进行校正，overlap区域碱基相同且质量>20的用于计算;⑤找出靶区域SNP/Indel位点;⑥对SNP、Indel位点进行注释，注释包括snpdb、基因注释、氨基酸注释等，注释采用annovar软件。
　　1.3统计学方法
　　采用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用χ2检验比较不同临床表型中各基因型的频率分布差异，以比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示相关基因型与肝癌临床表型的关联强度，并以性别、年龄等因素对P值、OR值进行校正。所有统计检验均为双侧检验，以P<0.05判定为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1 APE1基因-141位点SNP与肝癌临床表型的关联分析
　　在BCLC分期方面，该位点杂合突变基因型TG的患者较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.513，95%CI：1.411～14.445，P<0.05），纯合突变基因型GG较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.444，95%CI：1.217～16.233，P<0.05），突变基因型TG+GG较野生型TT患者出现较晚分期的风险增加（OR=4.491，95%CI：1.457～13.848，P<0.05）;在门脉侵犯方面，携带该位点杂合突变基因型TG的患者较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.091， 95%CI：1.019～10.064，P<0.05），纯合突变基因型GG患者较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.789，95%CI：1.025～14.009，P<0.05），突变基因型TG+GG较野生型TT患者发生门脉侵犯的风险增加（OR=3.302，95%CI：1.061～10.276，P<0.05）;在淋巴结转移方面，该位点各基因型发生淋巴结转移的风险无明显关联（P>0.05）;在远处转移方面，该位点纯合突变基因型GG的患者较野生型TT患者发生远处转移的风险增加（OR=5.667，95%CI：1.074～29.891，P<0.05）;该位点其他基因型与野生型TT患者发生远处转移的风险无明显关联（P>0.05）（表1）。 　　2.2 APE1基因148位点SNP与肝癌临床表型的关联分析
　　该位点各基因型与BCLC分期、门静脉侵犯、远处转移发生风险无明显关联（P>0.05）;携带该位点纯合突变基因型GG患者较野生型TT患者发生淋巴结转移的风险增加（OR=3.500，95%CI：1.018～12.03，P<0.05），而该位点其他基因型与野生型TT患者发生淋巴结转移的风险无明显关联（P>0.05）（表2）。
　　3讨论
　　APE1又称为氧化还原因子1（Ref-1），定位于14号核苷酸，3′端不翻译区（216个核苷酸）和一个polyA尾构成。转录区长度约为216 kb，包含5个外显子和4个内含子，其中第一个外显子为非编码区。脱嘌呤嘧啶（AP）位点是DNA最常见的损伤位点之一，在正常生理状态下，人体一个细胞每天约有10 000个脱嘌呤位点和500个脱嘧啶位点产生。除自发脱嘌呤脱嘧啶作用外，烷化剂、氧自由基、电离辐射等因素也可引起DNA损伤，形成AP位点。如不能对其进行修复，可妨碍DNA复制，引起基因突变、染色体微卫星不稳定性或细胞凋亡，甚至导致肿瘤的产生。BER途径是细胞对包括烷化剂和氧化剂在内的多种环境致癌物所引起的DNA损伤进行修复的主要途径。目前已知该途径由APE1、OGG1、XRCC1、TDG、MBD4、MYH、NTH1、MPG等在内的37个基因组成，共同发挥作用。APE1作为BER途径中的关键基因之一，具有DNA修复以及氧化还原双重功能，可调节多种转录因子的DNA结合活性，参与细胞增殖、分化、凋亡等反应。该基因在修复DNA损伤、维持DNA完整性中起着重要作用。其功能异常与恶性肿瘤的发生、發展密切相关[11]。
　　目前国内外文献报道中，针对APE1基因SNP与肿瘤疾病的相关研究主要集中在肺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤的易感性方面[12-16]，而与肿瘤临床表型的相关性研究甚少。目前仅发现白介素-8（IL-8）、HJURP、XPG等基因SNP与肝癌临床表型相关性的研究报道[17-19]。而临床实践中，针对不同的临床表型，治疗方案不尽相同，并以其作为判断疗效及预后的重要参考依据。因此，对APE1基因SNP与肝癌临床表型相关性的研究，有助于临床制定肝癌治疗方案，判断疗效及预后，具有较高的临床参考价值和现实意义。
　　本研究以APE1基因-141T/G（rs1760944）和148Asp/Glu（rs1130409）SNP为切入点，探讨其与肝癌不同临床表型的相关性，从而为临床制定治疗方案，判断预后带来帮助。本研究结果显示，与-141位点野生基因型TT相比较，该位点突变基因型TG、GG出现较晚BCLC分期、发生门脉侵犯的风险显著增加，该位点纯合突变基因型GG较野生基因型TT发生远处转移的风险显著增加（P<0.05），而该位点SNP与淋巴结转移无明显关联（P>0.05）。148位点纯合突变基因型GG患者较野生基因型TT患者发生淋巴结转移的风险显著增加（P<0.05），而该位点SNP与BCLC分期、门静脉侵犯、远处转移无明显关联（P>0.05）。提示携带两位点野生基因型的患者较突变基因型患者可能有更好的临床预后。通过检测这两个位点的基因型，从分子生物学水平预判肝癌不同临床表型，包括BCLC分期、门静脉侵犯、淋巴结转移、远处转移等，从而对患者治疗方案的制定及预后进行综合判断。虽然本研究得出阳性结果，但由于样本量偏少，可能存在选择偏倚，且肝癌的生物学行为受到肿瘤的异质性、器官微环境不同等诸多因素的影响，另外，本研究仅对关联性表象加以分析，未深入研究相关机制，因此本研究只能视为初步研究。在今后的工作中，将不断扩充样本量，扩大样本范围，增加相关机制研究，简化检测流程，并注意减少相关因素的干扰，以期获得更有质量、更有说服力的研究成果。
　　综上所述，APE1基因SNP与肝癌患者的BCLC分期、门静脉侵犯、淋巴结转移、远处转移等临床表型存在相关性，检测相关位点基因型有可能对肝癌患者制定治疗方案及预后判断带来帮助。
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　　（收稿日期：2020-02-19  本文编辑：任秀兰）
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