人参皂苷Rb1对脑缺血再灌注损伤小鼠LncRNAMalat1表达的调控作用

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　　[摘要] 目的 探討人参皂苷Rb1是否可以增加脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达。方法 将30只C57/B6小鼠按随机数字表法分成假手术组、模型+生理盐水对照组、模型+人参皂Rb1组，每组10只。采用大脑中动脉闭塞（MCAO）法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型。人参皂苷Rb1组和模型组大鼠在制模后即刻分别腹腔注射人参皂苷Rb1（40 mg/kg）和等量生理盐水。再灌注损伤后24 h观察各组小鼠的神经行为学评分、脑梗死体积、Bcl-2蛋白表达量和LncRNA Malat1含量。 结果 与假手术组相比，模型组小鼠神经行为学评分和脑梗死体积明显增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表达量和LncRNA Malat1表达水平明显增加（P<0.05）;与模型组相比，人参皂苷Rb1组小鼠神经行为学评分和脑梗死体积明显减少（P<0.05），Bcl-2蛋白表达量和LncRNA Malat1表达水平进一步增加（P<0.05）。 结论 人参皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神经行为学评分、减小脑梗死体积和增加Bcl-2蛋白表达量。人参皂苷Rb1具有脑保护作用，其可能的机制与增加小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达有关。
　　[关键词] 人参皂苷Rb1;脑缺血再灌注损伤;LncRNA Malat1;MCAO
　　[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0041-04
　　Regulation effect of ginsenoside Rb1 on the expression of LncRNA Malat1 in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury
　　WANG Leilei   DAI Qinxue
　　The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325800， China
　　[Abstract] Objective To investigate whether ginsenoside Rb1 can increase the expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods Thirty C57/B6 mice were divided into sham operation group， model+normal saline control group， model+ginsenoside Rb1 group according to random number table method， with 10 mice in each group. The cerebral ischemia-reperfusion injury model in mice was established by using middle cerebral artery occlusion（MCAO） method. Rats in the ginsenoside Rb1 group and model group were injected intraperitoneally with ginsenoside Rb1（40 mg/kg） and the same amount of normal saline immediately after modeling. The neuroethology score， cerebral infarction volume， Bcl-2 protein expression and LncRNA Malat1 content of mice in each group were observed 24 hours after reperfusion injury. Results Compared with those of the sham operation group， the neurobehavior score and cerebral infarction volume of the model group were significantly increased（P<0.05）， the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were significantly increased（P<0.05）. Compared with those of the model group， the neurobehavioral score and cerebral infarction volume of the ginsenoside Rb1 group were significantly reduced（P<0.05）， and the expression levels of Bcl-2 protein and LncRNA Malat1 were further increased（P<0.05）. Conclusion Ginsenoside Rb1 can improve the neuroethology， reduce the volume of cerebral infarction and increase the expression of Bcl-2 protein in MCAO mice. Ginsenoside Rb1 has a protective effect， and its possible mechanism is related to the increased expression of LncRNA Malat1 in the penumbra of cerebral infarction in mice. 　　[Key words] Ginsenoside Rb1; Cerebral ischemia-reperfusion injury; LncRNA Malat1; MCAO
　　中风是全球死亡的主要原因之一，也是长期致残的主要原因[1]。尽管许多中风治疗的临床试验已经完成，但迄今为止唯一有效的治疗方法是溶栓治疗，其仅在狭窄的时间窗内有效。临床环境中有效治疗的发展受到多种原因的严重限制，包括缺血后脑损伤的快速发展、信号通路之间复杂的相互作用以及特定靶标的治疗窗口[2]。人参皂苷是一类特殊的三萜皂苷，可治疗多种炎症信号通路失调的疾病。人参皂苷Rb1，是从人参提取出的最丰富的生物活性形式[3]，具有脑保护作用[4，5]。长链非编码RNA Malat1是研究最广泛的LncRNA之一。Malat1 RNA的3'末端形成独特的三螺旋结构，能够保护其3'末端免受3'-5'外切核酸酶的影响[6]。研究报道LncRNA Malat1在糖氧剥夺后培养的脑微血管内皮细胞和缺血性卒中后的小鼠中发挥抗凋亡和抗炎作用[7]。另有研究报道，LncRNA Malat1通过调节MDM2和p53信号通路影响缺血性卒中，为缺血性卒中患者提供更有效的临床治疗策略[8]。总的来说，这些结果表明Malat1在缺血性卒中中起着重要的保护作用。然而人参皂苷Rb1对LncRNA的调控效应近年来未有报道。本实验观察人参皂苷Rb1对MCAO小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达，为人参皂苷Rb1的脑保护机制探讨新的机制，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1仪器与试剂
　　人参皂苷Rb1（上海同田生物技术有限公司，批号：10073425）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶液（美国Sigma化学试剂公司）;蛋白定量 BCA 试剂盒（Thermo 科技公司）;多波长酶标仪（美国 Bio-TEK 公司）;0.9%氯化钠溶液;4%水合氯醛;PCR试剂盒（美国赛默飞世尔科技）。
　　1.2 动物选择与分组
　　健康雄性C57/B6小鼠48只，体重（22±3）g，动物编码：2017010422641。由温州医科大学动物房提供，饲养于标准动物房中并自由觅食。手术前一日禁食但不禁饮。将30只小鼠按随机区组的原则分为三组：假手术组、模型+生理盐水对照组、模型+人参皂苷Rb1组，每组10只。
　　1.3 小鼠局灶性脑缺血模型
　　雄性C57/B6小鼠，由温州医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009。将小鼠圈养在环境受控的室内，在12 h光照/黑暗循环下，随意自由获取食物和水。按照大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型[9]，小鼠全身麻醉（10%水合氯醛，0.3 mL/100g，i.p.）后仰卧位固定，取出颈部毛发后，颈部正中切口，逐步分离右侧颈内动脉与颈外动脉，并将颈外动脉结扎并剪断，然后再拉直颈内动脉与颈外动脉成一条直线。将专用的线栓（线头直径为0.32 mm）由颈外动脉断端处插入，经颈总动脉进入大脑中动脉起始处。栓塞1 h后拔出线栓，形成缺血再灌注损伤模型，切口处结扎缝合。当小鼠苏醒后进行神经行为学评分（标准见1.5），评分≥1分则视为制模成功。假手术组动物接受与MCAO相同的颈动脉手术暴露。再灌注24 h后取出小鼠的脑梗死半暗带区和脑组织用于进一步分析。
　　1.4 人参皂苷Rb1给药方法
　　将人参皂苷Rb1粉末溶解于生理盐水中配置成2 mg/mL注射液。人参皂苷Rb1组的小鼠在模型建立成功后立刻注射人参皂苷Rb1注射液（40 mg/kg，i.p.）[10]，假手术组的小鼠腹腔注射等量生理盐水，其他操作同模型组小鼠。
　　1.5 神经行为学评分
　　采用单盲法在脑缺血再灌注损伤24 h时对各组小鼠行神经行为学评分[9]。具体评分标准：0分：无功能障碍;1分：造模对侧前肢不能伸展;2分：向左侧旋转圈;3分：左侧倾倒;4分：没有自主活动并伴有意识障碍。
　　1.6 小鼠脑梗死体积测定方法
　　再灌注24 h時，小鼠麻醉断头处理，在冰面上取出脑组织，将脑组织放置在脑模具中进行冠状切片，置于氯化三苯四唑（TTC）溶液中常温浸泡20 min，未染色部分（白色）为脑梗死区域，染色为红色的部分为正常组织。用照相机拍照后存储于电脑上，再用Image-Plus 6.0软件进行分析。脑梗死体积（%）=脑梗死体积/全脑体积×100%。
　　1.7 定量实时PCR
　　用Trizol法从小鼠脑梗死半暗带区（1 mL/100 mg）提取总RNA。在测量单链RNA的浓度后，使用随机六聚体（Thermo fisher scientific）在以下条件下合成cDNA：25℃下5 min，42℃下60 min和70℃下5 min。使用iTap Universal SYBR Green supermix（Bio-Rad）和以下引物进行实时RT-PCR： Malat1 forward（5'-GGCGGAATTGCTGGTAGTTT-3'）; Malat1 reverse（5'-AGCATAGCAGTACACGCCTT-3'）;GAPDH forward（5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'）;GAPDH reverse（5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'）。使用以下条件进行PCR反应：95℃3 min，39个循环95℃10 s，55℃30 s。在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）上进行反应，并用CFX Manager软件（Bio-Rad）分析结果。采用相对定量法（△△Ct法）进行半定量分析，目的基因的相对表达量用2-△△Ct数值表示。 　　1.8 Western Blot法检测脑梗死半暗带区Bcl-2蛋白表达量
　　各组大鼠再灌注损伤24 h时处死取出脑梗死半暗带区。总蛋白的提取采用细胞蛋白提取试剂盒，按照说明书的步骤操作。等量样品经聚偏二氟乙烯膜分离蛋白转移至NC膜上，转移后的NC膜经BSA孵育1 h，再封闭后，分别加入Bcl-2抗体单克隆抗体，4℃孵育12 h。室温下摇床冲洗，再孵育二抗后显影、成像。β-actin作为内参对照。应用Alphaimager 2200凝膠图像处理系统分析目的蛋白。蛋白表达水平用目的蛋白条带光密度值与β-actin条带光密度值的比值来表示。
　　1.9 统计学分析
　　使用GraphPad Prism 7.0软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。使用单向ANOVA和双向ANOVA，然后进行方差分析检验。神经行为学评分采用中位数（范围）表示，组间比较采用非参数秩和检验 Kruskal-Wallis法，两两比较用Nemenyi法。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 人参皂苷 Rb1可以改善MCAO小鼠神经行为学评分
　　评估再灌注后24 h时MCAO小鼠神经行为学评分。与假手术组相比，模型组小鼠神经行为学评分明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，人参皂苷Rb1组小鼠神经行为学评分明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2 人参皂苷 Rb1减少MCAO小鼠脑梗死体积
　　评估再灌注后24 h时MCAO小鼠脑梗死体积。与假手术组相比，模型组小鼠脑梗死体积明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，人参皂苷Rb1组小鼠脑梗死体积明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、封三图7。
　　2.3 人参皂苷Rb1增加MCAO小鼠脑梗死半暗带区Bcl-2蛋白表达量
　　评估再灌注后24 h后小鼠脑梗死半暗带区Bcl-2蛋白表达量。与假手术组相比，模型组Bcl-2蛋白表达量增加，差异有统计学意义（P<0.05）;人参皂苷Rb1组Bcl-2蛋白表达量较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。
　　2.4人参皂苷 Rb1增加MCAO小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达
　　评估再灌注后24 h后小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达。与假手术组相比，模型组LncRNA Malat1表达水平增加，差异有统计学意义（P<0.05）;人参皂苷Rb1组LncRNA Malat1表达水平较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　表2   各组小鼠脑梗死体积、Bcl-2蛋白表达量、LncRNA Malat1表达水平比较（x±s）
　　注：与假手术组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05
　　3 讨论
　　越来越多的证据表明LncRNAs是生理和病理反应的重要调节因子[11，12]。最近，表观基因组学的进展正集中于缺血性卒中LncRNAs的神经保护作用[13]。据研究报道成年大鼠经短暂MCAO后LncRNA FosDT表达增加，且LncRNA FosDT 敲除后可显著改善缺血后运动障碍，并减少梗死体积[14]。LncRNA Malat1首次报道是与肺肿瘤的转移相关;Ji P等[15]发现，Malat1的表达与非小细胞肺癌患者的转移显著相关。在一项RNA测序研究中，Malat1首次报道参与了脑微血管缺血损伤后的保护作用;体外模拟缺血性卒中条件的缺氧-葡萄糖剥夺（OGD）后，培养的脑血管内皮细胞（BMECs）中Malat1水平升高;短暂MCAO 1 h和再灌注24 h后，小鼠大脑微血管中的Malat1水平也升高[14]。Malat1敲除显著增加糖氧剥夺诱导的内皮细胞死亡，且Malat1敲除显著增加小鼠局灶性缺血后梗死体积，加重神经功能缺损[7]。结果表明LncRNA Malat1在开发新的卒中治疗具有巨大的潜力。
　　人参皂苷是人参根中主要的生物活性化合物，具有抗氧化、免疫调节和抗炎活性。大量的研究证实人参皂苷Rb1脑保护作用的存在。人参皂苷Rb1通过激活PI3K/Akt通路抑制自噬有助于保护神经元免受缺血性损伤[16]。血脑屏障可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义[17]。Chen W等[18]发现ICR小鼠接受MCAO并在再灌注后3 h通过腹膜内注射接受GS-Rb1，可抑制血脑屏障的破坏，增加紧密连接蛋白（跨膜蛋白、细胞质辅助蛋白）的表达，抑制MMP-9和NOX4衍生的自由基来保护缺血性卒中血脑屏障完整性的丧失，发挥脑损伤治疗作用。本研究显示人参皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神经行为学评分、减少脑梗死体积以及增加脑梗死半暗带区Bcl-2蛋白表达量，说明人参皂苷Rb1对MCAO小鼠具有脑保护作用，但具体的机制并不完全明确。
　　本研究显示，人参皂苷Rb1增加脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达水平。因此，人参皂苷Rb1对脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用可能是通过上调LncRNA Malat1表达来实现的。但本研究也有不足之处，对其下游分子未做进一步研究。Xu Y等[19]报道LncRNA Malat1可通过下调miR-145和上调SOX9来促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并抑制细胞周期和凋亡。徐慧等[20]报道人参皂苷Rb1可以通过减少MCAO大鼠脑组织中miR-145含量，从而上调SOD活性，最终对MCAO大鼠产生脑保护作用。因此，人参皂苷Rb1可能通过上调LncRNA Malat1含量，竞争性结合miR-145发挥海绵作用，从而增加MCAO小鼠脑组织SOD活性，进而产生脑保护作用。但其结论还有待进一步研究。 　　综上所述，人参皂苷Rb1可以改善MCAO小鼠的神经行为学评分、减小脑梗死体积以及增加脑梗死半暗带区Bcl-2蛋白表达量。人参皂苷Rb1具有脑保护作用，其可能的机制与增加小鼠脑梗死半暗带区LncRNA Malat1的表达有关。
　　
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　　（收稿日期：2020-03-27）
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