姜黄素对骨关节炎软骨细胞增殖及分泌MMP-13、IL-6的影响

作者:未知

  [摘要] 目的 探讨姜黄素对骨关节炎(OA)软骨细胞增殖及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响。 方法 选取2018年1~6月在我院骨科接受关节置换的10例骨关节炎患者的关节软骨,设为炎症软骨细胞组(OA组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(OAa组)与加入姜黄素组(OAb组);另选取因外伤致截肢的4例患者膝关节软骨为对照,设为正常软骨细胞组(N组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(Na组)与加入姜黄素组(Nb组)。进行软骨细胞培养,配制姜黄素溶液,加入姜黄素溶液(80 μmol/L)刺激软骨细胞,采用MTT法检测软骨细胞增殖,测定上清液MMP-13、IL-6水平。 结果 OAb组吸光度值明显低于OAa组(P<0.05),Nb组吸光度值较Na组下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。OAb组上清液MMP-13、IL-6水平均低于OAa组(P<0.05),OA组MMP-13、IL-6水平均高于N组(P<0.05)。 结论 姜黄素对OA软骨细胞增殖及释放MMP-13、IL-6均有明显抑制作用,可保护关节软骨细胞,减轻炎症反应。
  [关键词] 姜黄素;骨关节炎;软骨细胞增殖;基质金属蛋白酶-13;白细胞介素-6
  [中图分类号] R684.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701(2020)26-0038-03
  [Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin on the proliferation of osteoarthritis chondrocytes and the secretion of matrix metalloproteinase-13(MMP-13) and interleukin-6(IL-6). Methods The articular cartilage of 10 patients with osteoarthritis who underwent joint replacement in the orthopedics department of our hospital from January to June 2018 was selected as the inflammatory chondrocyte group(OA group). And the OA group was divided into the simple medium group(OAa group) and curcumin-added group(OAb group). The knee cartilage of 4 patients who were amputated due to trauma was selected as the normal chondrocyte group(group N). The group N was divided into normal chondrocyte group(Na group) and curcumin-added group(Nb group). The chondrocytes were cultured, and the curcumin solution was prepared. The curcumin solution(80 μmol/L) was added to stimulate the chondrocytes. The proliferation of the chondrocytes was measured by the MTT method, and the levels of the supernatant MMP-13 and IL-6 were determined. Results The absorbance value of the OAb group was significantly lower than that of the OAa group(P<0.05). And the absorbance value of the Nb group was lower than that of the Na group, but the difference was not statistically significant(P>0.05). The levels of MMP-13 and IL-6 in the supernatant of the OAb group were lower than those in the OAa group(P<0.05), and the levels of MMP-13 and IL-6 in the OA group were higher than those in the group N(P<0.05). Conclusion Curcumin can significantly inhibit the proliferation of OA chondrocytes and release of MMP-13 and IL-6, protect articular chondrocytes and reduce inflammation.
  [Key words] Curcumin; Osteoarthritis; Chondrocyte proliferation; Matrix metalloproteinase-13; Interleukin-6
  骨關节炎(Osteoarthritis,OA)是一种临床常见的慢性骨关节疾病,患者常有关节疼痛、活动受限等症状,以退行性关节软骨病变及骨质增生为主要病理表现,多见于中老年人[1]。目前临床治疗OA的方法较多,但大多仅能缓解症状,无法解决根本问题,也不能扭转疾病恶化趋势,最终需行关节置换[2]。近年来,随着中医药研究的进一步深入,中医药防治OA的价值受到广泛关注,现已成为研究热点。姜黄是一味用于骨伤疾病治疗的常见中药,可活血行气、通经止痛,其有效成分姜黄素能抑制骨关节炎症,减轻炎症反应,保护骨关节,具有与非甾体类抗炎药物(Non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)类似的抗炎和抗肿瘤活性[3-5],但其用于OA的效果及作用机制仍有待进一步明确。本研究以OA患者关节软骨和正常关节软骨为研究对象,观察姜黄素对OA软骨细胞增殖及分泌MMP-13、IL-6的影响,旨在为姜黄素治疗该病提供依据。   1 资料与方法
  1.1一般资料
   选取2018年1~6月在我院骨科接受关节置换治疗的10例骨关节炎患者为研究对象,均符合OA相关诊断标准[6],其中男6例,女4例,年龄52~69岁,平均(62.37±2.56)岁。另选取因外伤致截肢的4例患者作为对照,其中男2例,女2例,年龄50~68岁,平均(61.24±2.49)岁。所有患者均排除严重心血管疾病、内分泌疾病、肝肾疾病、结缔组织疾病或肿瘤疾病患者,于术中取关节软骨。将炎症软骨细胞(OA组)和正常软骨细胞(N组)随机分为两组。两组患者的性别、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
  1.2 试剂
  姜黄素(Sigma公司,货号78246-100MG)、MTT细胞增殖及细胞毒性测试试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)、胰蛋白酶-EDTA(GIBCO公司,货号25200-056)、胎牛血清(FBS,购自上海双洳生物科技有限公司,货号12657-029)、DMEM/F12(HyClone公司,货号SH30023.01B)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)MMP-13、IL-6试剂盒(Ray Biotech公司)等。
  1.3 方法
  1.3.1 软骨细胞培养  于无菌条件下取关节软骨,以磷酸缓冲盐溶液漂洗,剪切成碎块(1 mm3),加入含DMEM全培养基的0.2%Ⅱ型胶原酶,消化约16 h,以200目滤网收集软骨細胞,经洗涤、离心处理后弃上清液,重复操作3次。细胞和全培养基装入细胞培养瓶,置入培养箱(37℃、5%CO2饱和湿度)培养,3 d换液1次。待细胞贴壁生长、基质分泌连接成单层时给予1∶2传代培养,选取2~3代软骨细胞。将炎症软骨细胞设为炎症软骨细胞组(OA组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(OAa组)与加入姜黄素组(OAb组);将正常膝关节软骨细胞设为正常软骨细胞组(N组),按是否加入姜黄素分为单纯培养基组(Na组)与加入姜黄素组(Nb组)。
  1.3.2 姜黄素溶液配制及刺激软骨细胞  以DMSO配制500 mol/L贮存溶液,在121℃条件下高压灭菌20 min,分装并于-20℃下保存,本实验中所用溶液以含10%FBS DMEM配置1000 μmol/L。将培养软骨细胞(1×107/L,100 μL)接种于96孔板中,接种24 h,细胞贴壁后吸去培养液。加入终质量浓度为80 μmol/L的姜黄素溶液,每孔100 μL,各组均6复孔,以未加入姜黄素的培养基作为对照,持续培养24 h后待检。
  1.3.3 MTT实验  细胞培养后按MTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒操作说明进行检测,方法如下:在软骨细胞培养孔中加入MTT10 μL,37℃条件下孵育4 h后加入Formazan溶解液100 μL,室温下震荡10 min,测定吸光度值、波长(测定为570 nm),以4孔吸光度值±标准差表示结果,抑制率=(1-A/B)×100%,A:给药孔平均吸光度值,B:对照孔平均吸光度值。
  1.3.4 ELISA实验  对上述上清液严格按试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书进行检测,测定上清液中MMP-13、IL-6水平,于相同条件下重复进行3次检测,于450 nm波长下以酶标仪测定吸光度值,计算结果并做对比分析。
  1.4 统计学方法
  数据应用SPSS20.0统计学软件进行分析,计量资料(吸光度值、MMP-13、IL-6水平等)用(x±s)表示,采用t检验,多组间、组间比较分别行ANOVA、LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 各组软骨细胞增殖抑制情况比较
  OAb组吸光度值明显低于OAa组(P<0.05),Nb组吸光度值较Na组下降,但差异无统计学意义(t=2.316,P=0.082>0.05)。80 μmol/L的姜黄素对OA软骨细胞和正常软骨细胞均有一定程度的抑制作用。见表1。
  2.2 各组上清液MMP-13、IL-6水平比较
  OAb组上清液MMP-13、IL-6水平均低于OAa组(P<0.05);OA组MMP-13、IL-6水平均高于N组(P<0.05)。见表2。
  3 讨论
  目前,骨关节炎的发病机制尚未完全阐明,关节软骨是该病发病早期最主要的侵犯部位,其自我修复能力有限,受破坏后很难彻底恢复。软骨细胞是关节软骨内唯一能分泌软骨基质的细胞,关节内环境变化后软骨细胞会识别并应答,进而分解、合成细胞外基质,以维持内环境稳定[7-8]。现代医学研究显示[9-10],在骨关节生长及损伤修复过程中Wnt/β-catenin通路发挥着关键作用,其激活和抑制对软骨细胞等多种细胞的分化、增殖有重要影响,且与软骨活力密切相关。
  中医古籍中并无“骨关节炎”这一病名,该病与“鹤膝风”“膝痛”“骨极”“筋伤”等病名类似,但病因、病情及症状并不一致。中医学将骨关节炎纳入“痹证”范畴,也有部分学者认为与“痿证”相关[11]。中医学研究认为负重、外伤、风寒湿等六淫病邪是引发骨关节炎的外因,中老年人体弱多病、气血已衰、正气薄弱,因而会加大骨关节炎的患病风险[12-13]。目前,研究证实传统中医药在关节软骨缺损及损伤修复中有重要应用价值,且中药复方治疗骨关节炎确有理想疗效[14],近年来的基础研究亦指出部分可用于痹证治疗的中药能促进软骨细胞增殖分化。
  姜黄是一种芭蕉目姜科植物,其味辛、温,无毒,具有破瘀行气、通经止痛之效,主治心腹痞满胀痛、妇女血瘀经闭、风湿痹痛等,尤适用于除痹痛[15]。姜黄素是姜黄的主要化学提取物,现代药理研究发现姜黄素有抗氧化、抗炎、抑菌、抗凝、降压和抗癌等多种作用,能强力抑制炎症反应与代谢递质活性,抗炎作用显著,并有保护OA关节软骨等作用[16]。有研究显示,40 μmol/L及以上浓度的姜黄素溶液具有明显抑制OA软骨细胞增殖的效应,80 μmol/L及以上浓度的姜黄素溶液对骨关节炎和正常软骨细胞均有抑制其增殖的作用[17]。本研究显示加入80 μmol/L浓度的姜黄素溶液后对骨关节炎软骨细胞增殖有抑制作用。姜黄素能通过抑制NF-kB及相关调节基因表达抑制部分细胞的生存与增殖基因,发挥抑制多种细胞增殖的作用,并可通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖并诱导其凋亡[18]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一种促使软骨细胞外基质降解的主要酶系,能发挥降解蛋白聚糖及胶原、抑制细胞外基质修复等作用,与OA关节软骨退变密切相关[19]。MMP-13是一种目前最有效的Ⅱ型胶原纤维降解酶,能降解软骨基质中的Ⅱ型胶原,在骨关节炎的发生、发展过程中扮演重要角色。IL-6是一种可趋化大量炎性细胞进入关节滑液的重要细胞因子,在很大程度上会增强炎症反应,刺激并扩大白细胞介素-1(IL-1)等细胞因子的炎症作用,抑制蛋白多糖合成,导致软骨退化加剧,是影响OA发病、进展的重要因素[20]。本研究结果显示,OA软骨细胞上清液MMP-13、IL-6水平较正常软骨明显增高,提示其可能参与了OA的炎症损伤及软骨退变,加入姜黄素溶液后上述指标均明显下降,表明姜黄素有显著的抗炎和抗降解作用,对软骨细胞可发挥保护作用,与既往研究结论一致[9]。   综上所述,姜黄素可抑制骨关节炎软骨细胞增殖,并有抗炎、抗降解等多种作用,可保护软骨细胞,其机制可能与姜黄素能参与激活Wnt/β-catenin中Wnt、β-catenin关键蛋白有关,上述作用机制以及何种浓度姜黄素促增效果相对最佳仍有待进一步深入研究。
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  (收稿日期:2019-10-10)
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