台州地区非结核分枝杆菌流行趋势研究

来源:用户上传      作者:丁仙红 王冬莲 陈佳喜

　　[摘要] 目的 了解台州地区临床流行的非结核分枝杆菌的种类和感染趋势，为临床诊疗NTM肺病提供依据。 方法 回顾性分析2015～2018年来源于台州市不同地区就诊和送检于恩泽医疗中心（集团）的1156株临床分离分枝杆菌菌株，采用基因芯片进行菌种鉴定。 结果 1156例分枝杆菌分离出非结核分枝杆菌228例，其中胞内分枝杆菌125例，浅黄分枝杆菌45例，鸟分枝杆菌20例，龟/脓肿分枝杆菌11例，草分枝杆菌16例，不产色分枝杆菌4例，金色分枝杆菌2例，堪萨斯分枝杆菌2例，瘰疬分枝杆菌1例，戈登分枝杆菌1例，海/溃疡分枝杆菌1例。男141例，占61.84%，女87例，占38.16%。 结论 台州地区非结核分枝杆菌感染有逐年上升的趋势，主要以胞内分枝杆菌为主，分离人群以男性居多。
　　[关键词] 结核;非结核分枝杆菌;基因芯片;菌种鉴定
　　[中图分类号] R521          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）26-0132-04
　　[Abstract] Objective To understand the types and infection trends of non-tuberculous Mycobacteria clinically prevalent in Taizhou， and to provide evidence for clinical diagnosis and treatment of NTM pulmonary disease. Methods A total of 1156 clinically isolated Mycobacterium strains admitted from different regions of Taizhou City and sent for inspection to Enze Medical Center （Group） from 2015 to 2018 were retrospective analyzed. Gene chip was used for strain identification. Results 228 cases of non-tuberculous Mycobacteria were isolated from 1156 cases of Mycobacteria， including 125 cases of intracellular Mycobacteria， 45 cases of Mycobacterium luteus， 20 cases of Mycobacterium avian， 11 cases of Mycobacterium tortoise/abscess， 16 cases of Mycobacterium tuberculosis， 4 cases of Mycobacterium chromogenes， 2 cases of Mycobacterium aureus， 2 cases of Mycobacterium kansas， 1 case of Mycobacterium dysentery， 1 case of Mycobacterium gordon and 1 case of Mycobacterium ulcerans. 141 men accounted for 61.84% and 87 women accounted for 38.16%. Conclusion Non-tuberculous mycobacterial infections have been increasing year by year in Taizhou， and the majority are intracellular mycobacteria. The segregated population is mostly male.
　　[Key words] Tuberculosis; Non-tuberculous mycobacterium; Gene chip; Strain identification
　　近年來由非结核分枝杆菌（Non-tuberculous mycobacleria，NTM）引起的肺部疾病在全球范围内呈增多趋势[1]，已成为全球性公共卫生挑战的疾病[2]。非结核分枝杆菌病是指除人型、牛型结核杆菌及麻风分枝杆菌以外由NTM引起的疾病，主要引起肺部的变化，与肺结核病的临床症状和病理变化极为相似，NTM分离鉴定有一定难度，临床往往误诊为结核病，且NTM对多种抗结核药物耐药[3]，故NTM感染性疾病诊治成为临床难点之一[4-8]。文献相继报道了不同地区非结核杆菌感染的分布情况，而台州地区无相关报道。恩泽医院属台州地区结核病诊治的定点医院，其他各县区定点医院培养阳性标本送检该单位进行鉴定和药敏实验。本次研究对台州地区2015～2018年就诊和送检于恩泽医院的1156株临床分离分枝杆菌菌株进行菌种鉴定，为台州地区NTM的流行趋势及菌种分布情况提供详细研究数据，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　1.1.1 标本来源  收集台州地区2015年8月～2018年12月就诊和送检于恩泽医疗中心（集团）恩泽医院分枝杆菌阳性患者的标本。
　　1.1.2 仪器和试剂  仪器：梯度PCR仪型号T100 THERMAL CYCLER，芯片杂交仪型号BioMixer Ⅱ，芯片洗干仪型号SlideWasher 8，微阵列芯片扫描仪（结核）型号LuxScan-10K/B为北京博奥提供。试剂：分枝杆菌鉴定基因芯片试剂盒购自博奥生物集团有限公司。 　　1.2 方法
　　1.2.1 标本处理  向标本（如痰液）中加入等体积10%NaOH溶液，涡旋振荡，根据液化情况考虑延长液化时间或增加0.5～1.0 mL 10% NaOH溶液。
　　1.2.2 核酸提取  ①将核酸提取管10 000 rpm离心1 min备用;②将液化后的样品取1 mL上清到1.5 mL离心管中，12 000 rpm离心5 min，弃上清;③向离心管中加入1 mL生理盐水，同一份样品用1 mL生理盐水转移至一个离心管中，旋涡振荡混匀，12 000 rpm 离心5 min，弃上清;④向每个离心管中加入50 μL核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，将液体和沉淀一起转移到核酸提取管中;⑤将核酸提取管置于振荡器上，最大转速振荡5 min;⑥将核酸提取管置于95℃金属浴中，加热5 min;⑦10 000 rpm离心1 min，备用。⑧从4℃冰箱取出PCR扩增试剂，向每管加入2 μL模板DNA。每份PCR反應体系总体积为20 μL。
　　1.2.3 核酸扩增  先将反应管放入PCR仪中进行PCR扩增反应。扩增结束前半小时左右，取出杂交反应液放入杂交仪温浴使其完全融化;扩增结束后，直接95℃变性5 min，变性结束后立即放入冰盒中至少3 min，准备杂交反应。
　　1.2.4 杂交反应  经盖片的加样孔加入13.5 μL杂交反应混合物，迅速盖上杂交盒并密封。立即将密封好的杂交盒水平放入 50℃预热的杂交仪中，杂交2 h，转速为5 rpm。
　　1.2.5 芯片洗涤  杂交结束前10 min，打开芯片洗干仪，将芯片放入洗干仪中，开始洗干芯片。
　　1.2.6 扫描判读  洗涤干燥好的芯片插入扫描仪进行结果判读。
　　1.3 观察指标
　　对所有收集的标本进行NTM检测，根据鉴定结果对NTM菌种每年的分布情况进行统计分析。
　　2 结果
　　2.1 NTM检测
　　共检测2015年8月～2018年12月收集的标本3132例，其中分枝杆菌阳性1156例，鉴定出非结核分枝杆菌228例，分离率为19.72%，2015～2018年每年的NTM检出率见表1。其中男141例，占61.84%，女87例，占38.16%，NTM的主要分离人群以男性为主。
　　2.2 NTM菌种的分布情况
　　此次鉴定出的228例非结核分枝杆菌中，其中以胞内分枝杆菌为主占54.82%，其余各种NTM分离率及每年的分离情况见表2。
　　3 讨论
　　目前分枝杆菌感染已经严重影响公共卫生健康，成为社会关注的重要问题[9-10]。分枝杆菌分为结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌等。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界中，在动物、土壤、水中都有发现[11]，不发生人与人之间的传播，但感染后能引起人体的广泛疾病，它可导致皮肤和软组织感染、淋巴结炎、慢性肺病及全身播散型NTM病[12]。
　　NTM病在亚洲地区和欧美国家发病率逐年上升[13]，在我国从5次的流行病学调查数据显示，NTM的检出率已从原来的4.2%增加到22.9%[14]。在韩国2015年NTM的感染率比2009年增加了一倍[15-16]。日本报道每年10万人中有14.7例感染[17]。台湾从2010～2014年每10万患者感染46.0例[18]。NTM的感染率和菌种分布不同地域、不同气候环境存在差异，呈现出南方高于北方，沿海高于内地，气候温和地区高于寒冷地区的流行特点[19]。台州位于中国东南沿海，气候温暖潮湿，是NTM的高发区。本研究检测了2015年8月～2018年12月台州市不同地区就诊和送检于台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院的1156例临床分离分枝杆菌菌株，通过基因芯片鉴定的方法，最终鉴定228例为非结核分枝杆菌，NIM总感染率或分离率为19.72%，明显高于内地湖南省的10.17%[20]、衢州市的4.78%[21]，接近全国20%～25%的感染率或分离率[22-24]，且逐年呈现上升的趋势。分离种类较多，其中排名前5的分别是胞内分枝杆菌（54.8%）、浅黄分枝杆菌（19.8%）、鸟分枝杆菌（8.8%）、草分枝杆菌（7.%）、龟/脓肿分支杆菌（4.8%），表明台州地区主要以胞内分枝杆菌感染为主，与温州、南京地区报道一致[25-26]。在我国海南、广州、上海以龟/脓肿分枝杆菌为主，北京以鸟/胞分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌为主，山东和福建以鸟/胞分枝杆菌复合群为主，因此菌种应地理环境的不同相差较大。NTM分离人群男性明显高于女性，与余斐等[27]的研究一致，与海南报道女性多于男性有一定的差异。
　　NTM的感染主要与人体免疫力相关，随着人们寿命延长，老年人口增多，老年人由于免疫器官衰退，免疫力低下是NTM的易感人群。近年来艾滋病患者人数越来越多，其感染HIV病毒后，人体CD4+T淋巴细胞严重破坏，使淋巴细胞数量进行性下降，更容易发生NTM的感染。且不同的NTM对治疗药物的敏感性存在差异，感染的宿主也存在差异。因此，如何快速准确鉴定到种对临床提早明确诊断和NTM流行病学研究非常重要。传统的分枝杆菌鉴定主要是PNB、TCH改良的罗氏培养法，操作繁琐，分枝杆菌的生长速度较慢，培养时间长，干扰因素多，无法精准的鉴定到种，极易对临床的诊治造成延误和产生耐药。本实验主要采用基因芯片技术，操作简便，鉴定时间短，结果更加准确，为临床及时诊断疾病和针对性用药提供参考。
　　 本研究还存在一定的局限，首先，这是一项回顾性分析，仅收集了一家医院的数据，未对台州地区其他医院所有分枝杆菌阳性标本进行鉴定。其次，本研究采用基因芯片的方法，由于方法学限定鉴定的菌种有限，存在漏检的可能。再次，本研究只对非结核分枝杆菌的菌种分布作了分析，未对其耐药情况进行研究，今后针对以上问题还需做进一步的研究。 　　[参考文献]
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　　（收稿日期：2019-10-25）
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