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重症脓毒症患者病原学诊断中应用高通量测序技术的价值分析

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  【摘要】目的探究高通量測序技术(HTS)对重症脓毒症患者的病原学诊断价值。方法选取122例重症脓毒症患者,随机分为研究组(62例)和对照组(60例)。研究组患者采用血培养(BC)联合HTS检测,对照组患者采用BC检测。两组患者均接受经验性抗感染治疗。统计病原学诊断结果及类型,并比较两组病原学诊断阳性率、病毒诊断阳性率;比较两组接受经验性抗感染治疗后诊断阳性率、重症监护病房(ICU)住院时间、28d生存率、并发症发生情况。结果研究组62例患者中58例患者病原学诊断结果阳性,对照组60例患者中24例患者病原学诊断结果阳性。研究组患者病原学诊断阳性率93.55%(58/62)高于对照组的40.00%(24/60),病毒诊断阳性率20.97%(13/62)高于对照组的0(0/60),差异均有统计学意义(X2=39.675、14.081,P<0.05)。接受经验性抗感染治疗后,研究组诊断阳性率为32.26%,高于对照组的15.OO%,差异有统计学意义(x2=5.012,P<0.05);两组并发症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。研究组ICU住院时间(10.04±2.06)d短于对照组的(18.25±2.87)d,28(1生存率85.48%高于对照组的56.67%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HTS检测范围广,能够提高对重症脓毒症患者病原微生物的诊断阳性率,为重症脓毒症患者抗感染方案的选择提供方向,以避免盲目使用抗生素,缩短ICU住院时间,提高生存率。
  【关键词】脓毒症;重症;高通量测序技术;病原学;诊断价值
  DOl: 10.14163/j.cnki.ll-5547/r.2020.19.002
  Value analysis of high-throughput sequencing technology in pathogenic diagnosis of patients withsevere sepsis CAO Yan.LLU Yi-Lin,et at Department of Critical Care Medicine,Yuebei People’s Ho.spital,Shaoguan 512026,China
  【Abstract】Objective To investigate the value of high-throughput sequencing (HTS)technology inpathogenic diagnosis of patients with severe sepsis. Methods A total of 122 patients with severe sepsis wererandomlv divided into research group 62 (cases) and control group (60 cases). Patients in the research groupreceived blood culture (BC) combined HTS test, and patients in the control group received BC test. Both groupsof patients received empirical anti-infective treatment. The results and types of pathogen diagnosis was collectedand the positive rate of pathogen diagnosis and virus diagnosis were compared between the two groups. Thediagnostic positive rate after empirical anti-infective treatment, hospitalization time in intensive care unit (ICU).28 d survival rate and occurrence of complications were compared between the two groups. Results There were58 patients with positive pathogen diagnosis in 62 patients of the research group, and 24 patients with positivepathogen diagnosis in 60 patients of the control group. The positive rate of pathogen diagnosis 93.55%(58/62) ofthe research group was higher than than of the control group 40.OO%(24/60), and positive rate of virus diagnosis20.97%(13/62) was higher than that of the control group 0(0/60), and the difference was statistically significant(X2=39.675, 14.081. P<0.05). After empirical anti-infective treatment, the diagnosis-positive rate of the researchgroup was 32.26%. which was higher than that of the control group 15.00%. and the difference was statisticallysignificant (X2=5.012, P<0.05). There was no statistically significant difference in incidence of complicationsbetween the two groups (P>0.05). The hospitalization time in ICU (10.04 ± 2.06) d of the research group wasshorter than that of the control group (18.25 ± 2.87) d. and 28 d survival rate 85.48% was higher than that of thecontrol group 56.67%, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion HTS has a widerange of detection. and can improve the diagnosis-positive rate of pathogenic micrrganisms in patients withsevere sepsis, and provide direction for the selection of anti-infective programs for severe sepsis to avoid blind useof antibiotics. shorten the hospitalization time in ICU, and improve survival rate.   【Key words】 Sepsis; Severe; High-throughput sequencing technology; Pathogenic; Diagnlstic value
  脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,可导致严重脓毒症和脓毒性休克,是ICU患者死亡的主要原因。据文献报道,全球脓毒症发病率约0.3%,病死率可达25%,并发脓毒性休克患者病死率高达80%[1]。高通量测序技术(high-throughput sequencing,HTS),即二代测序技术,近年来应用广泛,被证实可用于肿瘤的诊治、感染性疾病诊断、遗传疾病筛查[2]。国外研究显示,HTS常用于病毒感染诊断,相比血培养(bacterialculture,BC)具有明显优势[3]。但目前国内外HTS应用于脓毒症病原学诊断的前瞻性研究报道罕见。鉴于本院重症脓毒症约占脓毒症患者的2/3,本研究探析HTS对重症脓毒症患者病原学的诊断价值,以期为临床应用提供新的方向和依据。现报告如下。
  1资料与方法
  1.1 一般资料选取2016年7月-2019年10月本院收治的122例重症脓毒症患者为研究对象,随机分为研究组(62例)和对照组(60例)。研究组:男37例,女25例;年龄22-79岁,平均年龄(59.86±9.27)岁;急性生理学及慢性健康状况评分系统Ⅱ(acute physiologyand chronic health evaluationⅡ.APACHEⅡ)评分[4]11-17分,平均APACHEⅡ评分(14.26±3.24)分;序贯器官衰竭评估(sequential organ failure assessment. SOFA)[5]4-7分,平均SOFA评分(5.78±1.41)分。对照组:男35例,女25例;年龄24-77岁,平均年龄(59.29±9.18)岁;APACHEⅡ评分10-17分,平均APACHEⅡ评分(14.15±3.19)分;SOFA评分3-7分,平均SOFA评分(5.59±1.37)分。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入标准:①重症脓毒症符合《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南》[6]中诊断标准;②年龄>18岁;③患者家属知情同意。排除标准:①血液系统、自身免疫性疾病;②合并恶性肿瘤;③器官功能不全终末期;④入院24h内死亡;⑤妊娠、哺乳期妇女;⑥长期服用抗生素或其他影响本研究结果的药物;⑦严重创伤、甲状旁腺功能异常。所有患者及其家属知情同意本研究并簽署知情同意书。本研究所涉及的研究方法均遵循《赫尔辛基宣言》,符合医学伦理学原则,并获得粤北人民医院医学伦理委员会批准。
  1.2方法研究组患者采用BC联合HTS检测,对照组患者采用BC检测。具体如下。
  1.2.1 BC检测采用Bact/ALERT 3D血培养仪及配套血培养瓶进行BC;通过VITEK 2 Compact全白动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)进行病原微生物鉴定。
  1.2.2 HTS检测 ①构建DNA文库:对血样离心
  10 min/1600g,分离血浆,转移血浆至无菌试管;通过微量样本基因组DNA提取试剂盒(DP316,天根生化科技北京有限公司)提取血浆中DNA,用于DNA文库构建。②测序:先行PCR扩增f美国ABI公司,7500FAST型实时荧光定量PCR仪),并使用IonTorrent基因组测序仪(Life TeChnologies公司)分析,结合Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies公司)分析,评定DNA文库质量,而后进行测序。采用IonTorrent Proton测序仪(Life TeChnologies公司)对合格DNA文库展开测序,分析得出报告。③预处理及参考数据库:去除低质量序列、短序列(长度<35 hp),完成预处理;采用Burrows-Wheeler比对工具将测序数据与人类参考基因组(GRCh37)进行比对,并将数据与细菌、真菌、病毒数据库进行比对,读取计数及每种物种的基因组覆盖率。所有病原体序列参考数据库均来白NCBI。④测定病原体:根据以往对正常者血浆样品的测序计算细菌、真菌、病毒的参考范围,确定通过干净序列读数标准化的每种生物的检测值,采用箱线图计算正常样本范围,以Q3+3IQR最大、Q1-3IQR为最小(Q1、Q3分别为较低四分位数和较高四分位数,IQR为四分位数间距),获取细菌、真菌、病毒的读码数。根据以下确定患者是否存在病原生物:一是必须根据每种生物的覆盖率对一个样品中鉴定出的所有生物进行分类,获得了前十个清单则进一步分析;二是在前十个生物中,严格映射的读数必须为03,并且超过参考范围的上限,覆盖率也必须超过参考范围的上限。⑤Sanger测序验证:对于HTS和BC阳性结果,采用特异性PCR验证。将提取的DNA作为PCR反应模板,反应条件为:94。C5 min(94。C 30s;55℃50s;72℃30s),40循环,72℃5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并纯化;以ABI 3730基因分析仪进行Sanger测序,验证测序结果。
  两组患者均接受经验性抗感染治疗。
  1.3观察指标统计病原学诊断结果及类型,并比较两组病原学诊断阳性率、病毒诊断阳性率;比较两组接受经验性抗感染治疗后诊断阳性率、ICU住院时间、28d生存率、并发症发生情况。
  1.4统计学方法采用SPSS22.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用i检验;计数资料以率(%)表示,采用X2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
  2结果
  2.1病原学诊断结果及类型研究组62例患者中58例患者病原学诊断结果阳性,对照组60例患者中24例患者病原学诊断结果阳性。研究组患者病原学诊断阳性率93.55%(58/62)高于对照组的40.OO%(24/60),病毒诊断阳性率20.97%(13/62)高于对照组的0(0/60),差异均有统计学意义(X2=39.675、14.081,P<0.05)。见表1。   2.2两组接受经验性抗感染治疗后的诊断阳性率及并发症发生率比较接受经验性抗感染治疗后,研究组诊断阳性率为32.26%,高于对照组的15.OOo%,差异有统计学意义(X2=5.012, P<0.05);两组并发症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。見表2。
  2.3两组ICU住院时间、28 d生存率比较研究组ICU住院时间短于对照组,28 d生存率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
  3讨论
  目前ICU感染的病原学诊断仍然依赖于BC和分子技术,而BC被认为是诊断血流感染的金标准,但它阳性率较低,一般只能进行细菌/真菌培养,且并非所有的病原体都能被培养出,同时培养周期较长(3-7d),虽然反复培养可增加阳性概率,但同时将增加患者经济负担,且可能延误最佳治疗时机,因此它具有一定局限性[7,8]。国外研究报道,延迟th的有效抗菌及支持治疗可导致患者死亡率增加5%-10%[9]。而由于临床诊断技术层面的局限性,30%-50%脓毒症患者难以明确病原微生物,造成初治延迟或失败,增加病死率[10]。因此,探寻准确、快速的病原学诊断方法,以促进临床实施早期精准的抗感染治疗方案,提高重症脓毒症患者生存率,成为研究的重点。
  自2016年7月开始,本研究对传统的脓毒症病原学诊断方法进行了改良,在常规BC的基础上联合应用HTS对重症脓毒症患者进行病原体检测,取得了良好效果。研究组病原体诊断阳性率为93.55%,明显高于对照组(40.OO%),同时对于已经接受了经验性抗感染治疗的患者,研究组诊断阳性率(32.260%)明显高于对照组(15.OO%)。本研究进一步发现,研究组ICU住院时间明显短于对照组,28d生存率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。另近年Gumaz等[11]研究发现,与BC相比,HTS检测脓毒症的病原菌有较高的敏感性和特异性。HTS应用于ICU重症脓毒症患者病原微生物检测可提高诊断价值,这可能与HTS可筛选出标本中核酸所含种类,可全面分析物种转录组及基因组,还能够对宿主miRNAs进行检测,也可获得含量低的病原序列,并通过未知序列鉴定新物种,若预先定义每种病原微生物的特征序列谱,在测序结果中逐一比对,可以迅速识别各类病原微生物,使诊断时间缩短,诊断结果更加精确[12-14]。目前HTS能检测出约2700余种病原体,种类包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体、立克次氏体,48-96h得出报告,具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖度广及产出巨大等特点[15-16],特别是病毒、支原体、衣原体等少见病原体类型的病原学诊断,HTS较BC具有更加独特和明显的优势[ 17,18]。在重症脓毒症患者的治疗中,BC联合HTS可明显缩短ICU住院时间,同时可明显提高28d生存率,这可能与HTS能更快速和精准地检测出病原菌,促进临床早期选择合理的治疗方案,避免或减少抗生素的不合理应用,从而提高重症脓毒症患者的存活率,改善患者的治疗预后,同时也降低了患者的治疗费用。
  综上所述,HTS检测范围广且时间短,能够提高对重症脓毒症患者病原微生物的诊断阳性率,可为重症脓毒症患者抗感染方案的选择提供方向,以避免盲目使用抗生素,缩短ICU住院时间,提高生存率,具有重要应用价值。但本研究样本量较少,且全为本院患者,可能影响其可靠性,今后还有待进行大样本、多中心研究检验。
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  [收稿日期 : 2020-04-16]
  基金項目:韶关市科技汁划项目(项目编号:2018sn109);韶关市卫生计生科研项目(项目编号:Y18064)作者单位:512026粤北人民医院重症医学科
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