全反式维甲酸在慢性肾衰大鼠体内的变化及其意义

来源:用户上传      作者: 张　岭

　　[摘要] 目的：外源性全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, atRA）能延缓慢性肾衰的病理进程，因此我们在本研究中检测了慢性肾衰时内源性atRA的水平是如何波动的。方法：建立5/6肾大部切除的大鼠肾衰模型，采用反相高效液相色谱仪（RP-HPLC）检测了5/6肾大部切除大鼠不同时间点的血、肾组织atRA的水平。结果：与假手术组（sham）比较，单纯肾大部切除组（NX）血肌酐水平自第10周起明显高于sham组（P<0.05）。NX组大鼠血浆atRA在第2周有一个明显的升高，第7周降至接近正常或正常以下；NX组肾组织atRA水平自第2周时间点有明显升高，直到第10周才降至接近正常或正常以下，同sham组比较没有差异。sham组大鼠血浆和肾组织atRA的含量比较稳定。结论：正常大鼠血浆和肾组织内有atRA存在，含量比较稳定。5/6肾大部切除后，大鼠血浆和肾组织内atRA在短期内升高，以后明显下降，在中、晚期降至正常水平。
　　[关键词] 全反式维甲酸；5/6肾大部切除
　　[中图分类号]R96 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）06（a）-017-03
　　
　　Change of all-trans retinoic acid content in chronic renal failure rats and the meaning
　　ZHANG Ling
　　（The Fourth People's Hospital of Shenyang City, Shenyang 110031, China）
　　[Abstract] Objective: atRA is a kind of indispensible substance in human body. In order to understand the change of all-trans retinoic acid content in chronic renal failure rats, we have designed the following study. Methods: 5/6 nephroectomized rat model was used in this trial. The 5/6 nephroectomized rats were assigned into non-intervention group (NX group, n=48) and sham group (n=30). Eight rats in NX group and 5 in sham group were killed respectively in the beginning of the trial (week 0), week 2, 4,7, 10 and 13. RP-HPLC was used to examine atRA level in blood and kidney at those time point. Results: In NX group the plasma atRA content presented an obvious increase in the 2nd week and it reduced to normal or below normal value. Similarly, atRA content in kidney in NX group also presented an obvious increase in the 2nd week, which was higher than that of sham group. But unlike plasma atRA, kidney atRA content did not decrease immediately and it was still higher than that in sham group in the 4th and 7th week (P<0.05). Until the 10th week did it reduced to normal or below normal value. Either plasmic or renal atRA levels kept steady in sham. Conclusion: ① The atRA contents in palsma and kidney of healthy rats are steady. ② atRA contents in rat plasma and kidney after 5/6 renal ablation would increase for a short time followed by decrease and they reduce to normal value in middle or late stage.
　　[Key words] All-trans retinoic acid; 5/6 nephrectomy
　　
　　全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, atRA）是由维生素A在体内经过一系列酶促反应形成的活性衍生物，是机体必需的微量元素之一，在体内发挥着广泛的生物学作用。近来的研究发现， 给予肾衰大鼠大量外源性atRA能延缓慢性肾衰的病理进程[1，2]。因此我们首先想知道慢性肾衰时内源性atRA的水平是如何波动的。
　　在本试验中我们采用反相高效液相色谱仪（RP-HPLC）检测了5/6肾大部切除大鼠不同时间点的血、肾组织atRA的水平。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1动物实验动物选用180~200 g雄性Wistar大鼠78只，购自并饲养于中国医科大学实验动物中心（清洁级环境）。环境温度维持在（20±2）℃。定量饲料喂食（每只大鼠约15 g/d），各组相同，自由饮水。动物使用符合上海市动物管理委员会管理条例。
　　1.1.2主要试剂来源及配制方法atRA标准品购自上海中洋制药公司。Agilent 1100 型高效液相色谱仪，配备有G1311A 型四元泵，G1322A型脱气机，G1313A型自动进样器及G1314A 型紫外检测器。低温高速离心机为Model J2-21，Beckman公司制造。蛋白裂解液包括裂解液A：Tris-HCl Buffer、NaCl、EDTA、EGTA；裂解液B：PMSF、Aprotinin和β-巯基乙醇。
　　1.2方法
　　1.2.1 5/6肾大部切除大鼠模型的建立大鼠适应性正常饲养1周。术前应用30%水合氯醛（1 ml/kg）腹腔内麻醉，大鼠侧卧位于保温手术台上，左侧腹背部剪毛，清洗术区，取左侧背部侧切口，剪开皮肤及腹壁各层，充分暴露肾脏，将左肾动脉的后支及前降支单个结扎、剪断。使保持血供的肾组织为单肾体积的1/3。3 d后切除右肾(二期手术)。假手术大鼠仅分离左肾动脉分支，不予结扎，不摘右肾[3]。

　　1.2.2动物分组及给药手术后7 d，将术后恢复良好的大鼠随机分为两组：① 单纯肾大部切除组（NX），n=48；② 假手术组（sham），n=30。
　　1.2.3标本的留取
　　1.2.3.1血标本的留取分别于二期手术后7 d开始进入正式试验。先后在正式试验开始时（0周）和开始后第2、4、7、10和13周，NX和sham组分别处死8和5只大鼠。经腹主动脉插管，采集肝素抗凝血2 ml，2 000转/min低温离心（4℃）15 min，留取血浆部分，氮气吹扫后即刻分装，-70℃避光保存，统一检测。
　　1.2.3.2肾组织标本的留取取血后，经腹主动脉插管注入4℃预冷的PBS缓冲液反复灌洗至肾脏苍白，剪碎，经预冷的1×PBS洗涤2次，加入1 ml裂解液A＋B，匀浆，振摇冰浴30 min，应用低温高速离心机，4℃，15 000转/min离心20 min，取上清液即为细胞总蛋白。应用考马斯亮蓝试剂盒检测蛋白浓度后将标本调整至统一浓度，分装管内，氮气吹拂后，保存于-70℃冰箱待测。所用容器均以锡箔纸避光。
　　1.2.4检测指标及方法
　　1.2.4.1生化检测采用自动生化分析仪检测各组血清肌酐水平。
　　1.2.4.2反相高效液相色谱法检测血浆、肾组织atRA浓度分别吸取大鼠血浆和肾组织蛋白提取液50 μl，置于1.5 ml的Eppendorf管内，依次加入40 μl atRA提取液和15 μl饱和磷酸氢二钾溶液，于漩涡混合器上剧烈震荡3 min后，4℃下5 000×g离心5 min。吸出全部上清液置于200 μl离心管内，作HPLC分析。所有处理的样品在4 h内测定完毕。应用色谱峰的保留时间鉴别atRA。定量分析以色谱峰高为准。所有色谱数据由Agilent提供的软件“化学工作站”(Version A. 09.01)自动进行定量计算。
　　1.3统计方法
　　SPSS11.5统计软件，采用单因素方差分析。数值以均数±标准差表示，P<0.05为显著性差异标准。
　　2结果
　　2.1大鼠血清肌酐（SCr）水平
　　同sham组比较，NX组SCr水平自第10周起明显高于sham组，P<0.05，详见图1与表1。sham组SCr水平保持稳定，0、4、7、10、13周分别为(22.0±5.13)、(23.6±6.63)、(25.5±5.89)、(23.3±4.17)、(24.9±4.75) μmol/L。
　　2.2血浆以及肾组织atRA水平
　　2.2.1血浆atRA水平sham组大鼠血浆atRA保持在0.1 ng/ml左右，含量稳定。NX组大鼠血浆atRA在第2周有一个明显的升高，差异有显著性(P<0.05)；第7周降至接近正常或正常以下，见图2、表2。
　　2.2.2肾组织atRA水平在第2周时间点，NX组肾组织atRA水平同sham组相比有明显的升高（P<0.05），但与血浆atRA水平不同的是，NX组肾组织atRA水平没有立即下降，在第4周和第7周都明显高于sham组（P<0.05）；自第10周才降至接近正常或正常以下，同sham组比较差异无显著性。sham组大鼠肾组织atRA含量也比较稳定，浓度大约在10 ng/ml，明显高于血浆水平，见图3、表3。
　　3讨论
　　atRA是在体内的天然活性代谢产物，目前被视为维生素A发挥生物学活性的主要物质。维生素A（又名视黄醇）主要存在于动物来源的食物，在小肠内与小肠黏膜细胞内特异性结合蛋白-细胞型视黄醇结合蛋白（CRBP）结合，通过淋巴系统转运入血，在肝脏与极低密度脂蛋白结合储存于肝脏星形细胞。机体需要时，视黄醇去酯化入血，以视黄醇-RBP-PA复合体形式在血液中运输[4]。复合体到达靶细胞后释放维生素A，维生素A进入细胞后经过一系列酶促反应最后形成atRA。atRA是核受体的配体，直接进入细胞核激活配体后游离出来为细胞色素P450降解。
　　atRA对慢性肾衰的治疗意义是近来肾脏病界研究的热点之一。已经有部分研究表明慢性肾衰时给予外源性atRA能有效缓解肾纤维化，这提示在肾衰病理状态下内源性atRA量或质可能出现了变化，需要外源补充。
　　我们应用高效液相色谱的方法检测到的血浆和肾组织atRA，其滞留时间同标准品相同，因此可以认为慢性肾衰时大鼠体内的天然atRA没有质的变化。在量的方面，数据显示，5/6肾大部切除后肾组织atRA的水平在最初10周都是明显高于正常组的，从外源性atRA的抗纤维化作用推测，机体在丧失大部分肾单位后表现的内源性atRA升高可能是对抗肾脏损伤的一种代偿表现。但是这种代偿可能是不足的。atRA代偿不足的原因推测有以下几点：①5/6肾大部切除模型，肾单位大量丧失，肾脏损伤后机体既然产生的atRA量虽然较正常多，但仍不能有效平衡导致肾脏硬化的因素，需要外源补充；②atRA同核受体的亲和力下降。对于后面一点，我们在其他类似核受体的研究中已有发现。例如，同样是核配体的维生素D在肾衰时同其核受体结合力就明显降低，需要加大维生素D浓度才能发挥其正常情况下的生物学效应[5]。atRA同维生素D的作用途径相似，都是进入核内，激活核受体，因此有理由推测atRA的核受体在肾衰时可能出现同样的缺陷，只有较多量的atRA才能发挥抗纤维化作用。
　　研究atRA的抗残余肾纤维化作用时，肾组织内部的atRA浓度似乎更有意义。但我们的研究中发现，肾衰大鼠肾脏局部atRA并不平行，我们认为血浆atRA手全身维生素A代谢状态的影响很大，而肾脏局部的atRA水平应该更有意义。
　　本研究证实，正常大鼠血浆和肾组织内有atRA存在，含量比较稳定。5/6肾大部切除后，大鼠血浆和肾组织内atRA在短期内升高，以后明显下降，在中、晚期降至正常水平。
　　
　　
　　图1 NX组血清肌酐（SCr）和血清视黄醇结合蛋白（RBP）在不同时间点的水平
　　（同0周时间点比较，SCr水平有显著差异，*P<0.05；同0周时间点比较，RBP水平有显著差异，#P<0.05）
　　[参考文献]
　　[1]Schaier M, Liebler S, Schade K, et al. Retinoic acid receptor alpha and retinoid X receptor specific agonists reduce renal injury in established chronic glomerulonephritis of the rat[J].J Mol Med, 2004,82(2):116-125.
　　[2]Tatematsu S, Wakino S, Kanda T, et al. Role of nitric oxide-producing and -degrading pathways in coronary endothelial dysfunction in chronic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2007,18(3):741-749.
　　[3]Gretz N, Waldherr R, Strauch M. Experimental and genetic rat models of chronic renal failure[M]. Karger: Basel, 1993. 1-28.
　　[4]Mercader J, Madsen L, Felipe F, et al. All-trans retinoic acid increases oxidative metabolism in mature adipocytes[J]. Cell Physiol Biochem, 2007,20(6):1061-1072.
　　[5]de Souza CM, Braosi AP, Luczyszyn SM, et al. Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and susceptibility to chronic kidney disease and periodontitis[J].Blood Purif,2007，25(5-6):411-419.
　　（收稿日期：2008-02-14）
　　
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