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黑龙江省脊髓灰质炎实验室细胞系敏感性实验方法的建立与应用

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  【摘要】目的:制备黑龙江省疾病预防控制中心脊髓灰质炎(脊灰)实验室质量控制标准毒株(QC),评价黑龙江省脊灰实验室所用细胞系对的敏感性,并开展常规监测。方法:96孔微量培养板滴定法。结果:黑龙江省脊灰实验QC3次独立的细胞敏感性实验结果的滴度波动在土0.5log10 CCID50�,同时用中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室提供的已知滴度的中国sabin参考株(China Sabin Test Reference Strain;CSTRS)作平行对照,CSTRS株3次滴度结果与其本身提供的参考值相比较,其滴度波动均在士0.5log10 CCID50�范围内。开展的16次常规细胞系敏感性实验结果也均在士0.5log10 CCID50�范围内。结论:黑龙江省脊灰实验室QC结果以及脊灰实验室所用细胞系对脊灰病毒的敏感性达到实验规定要求。
中国论文网 /6/view-2737383.htm
  【关键词】脊髓灰质炎病毒;细胞系敏感性实验;中国疫苗参考株
  【中图分类号】R463【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2010)011-0157-01
  
  2005年黑龙江省CDC脊灰实验室从国家脊灰实验室引进RD(来源于人横纹肌肉瘤细胞)和L20B(来源于表达了人脊灰受体转基因小鼠肺细胞)的合格细胞系和国家脊灰实验室制备、鉴定,且已知滴度的中国Sabin参考株(CSTRS)。建立了本实验室细胞敏性实验方法,制备了本实验室质量控制的标准毒株(QC),并定期对本实验室的RD和L20B细胞系敏感性实施评价。�
  1 材料与方法
  1.1 标准病毒参考株标准Sabin脊灰病毒参考株由国家脊灰实验室提供,每管0.8 ml,低温运输,一80℃保存。
  1.2细胞从国家脊灰实验室获得的无支原体污染的合格RD和L20B细胞系。
  1.396孔微量培养板滴定法。
  1.3.1制备黑龙江省脊灰实验室质量控制的标准毒株。按照《脊髓灰质炎手册》[ 1]的方法和要求制备QC,将制备好的毒株按每管0.1ml分装,并写明所用的细胞、病毒的名称和接种日期,冻存作为黑龙江省脊灰实验室QC。
  1.3.2 细胞系敏感性实验 按照《脊髓灰质炎手册》[ 1]的方法和要求进行,通过Karber公式计算病毒滴度。
  1.4评价标准:制备的QC在使用前,要进行3次独立的滴度水平测定,同时用CSTRS作平行实验,CSTRS株3次滴度结果与其本身提供的参考值相比较,其滴度波动均在士0.5log10 CCID50�范围内,QC的滴度要高于CSTRS,且三次QC实验结果的滴度不应该超过士0.5 log10CCID50�,才可以确定QC滴度结果的有效性,QC标准值的确定取3次试验的平均滴度。在开展常规细胞系敏感性实验时,每次实验结果与已确定的QC参考值比较,其相应型别差值波动范围应在士0.5log10 CCID50�内,才提示细胞系的敏感性没有下降。�
  2 结果
  2.1 CSTRS参考标准株滴度(为三次独立细胞敏感性实验的平均值)CSTRS滴度sabinⅠ:在RD细胞上为4.90log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上为4.67 log10CCID50�/0.1ml;SabinⅡ:在RD细胞上5.10 log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上为4.83 log10CCID50�/0.1ml;SabinⅢ:在RD细胞上为4.82 log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上4.77 log10CCID50�/0.1ml。结果有效,滴度值均在CSTRS正常范围内。
  2.2确定黑龙江省脊灰实验室制备的QC参考株滴度参考值SabinI:在RD细胞上为8.27log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上为6.97 log10CCID50�/0.1ml;SabinII:在RD细胞上为8.23log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上为6.90 log10CCID50�/0.1 ml ;Sabin III:在RD细胞上为8.08 log10CCID50�/0.1ml,在L20B细胞上为6.62 log10CCID50�/0.1ml。结果有效符合评价标准。
  2.3 在制备并确定了黑龙江省脊灰实验室QC的滴度后,从2006年4月至2009年12月,黑龙江省CDC脊灰实验室按国家脊灰实验室要求对分离脊灰病毒的RD和L20B细胞分别进行了16次常规细胞敏感性实验,实验结果均在合格范围内,用于脊灰病毒分离的细胞敏感性没有下降。�
  3 讨论
  2000年10月我国实现无脊灰证实后,消灭脊灰工作取得了一定的阶段性成果。但是周边国家脊灰野病毒输入我国的危险依然存在,且近年来我国个别省份也发生了疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)循环病例,使我国维持无脊灰状态面临严峻的挑战。因此在AFP病例监测过程中,可靠的实验室检测,对我们及时发现VDPV和输入性脊灰野病毒具有重要意义,而实验室使用高敏感性病毒分离细胞是检测工作的前提。
  有多种因素会影响细胞的敏感性,包括细胞的生长代次、支原体污染、培养液的质量(如胎牛血清、水、pH值)、孵育温度等,因此在脊灰实验室需要对脊灰病毒分离细胞的敏感性进行评价。从2006年起,国家要求省级脊灰实验室每年都应对用于病毒分离的RD和L20B细胞系的敏感性进行常规监测,保持细胞的敏感性将不会漏掉含低滴度脊灰病毒的粪便标本,防止假阴性的病毒分离结果,以保证脊灰实验室网络的监测质量[ 2]
  黑龙江省脊灰实验室制备了本实验室的QC,至2009年底黑龙江省脊灰实验室开展了16次常规细胞敏感性实验,检测结果表明我省使用的RD和L20B细胞的敏感性一直能够保持正常,为维持无脊灰工作提供了可靠的技术保障。
  参考文献�
  [1] 世界卫生组织.脊髓灰质炎实验手册.第4版.2004:71~77�
  [2] 王东艳,赵蓉,安洪秋,等.脊髓灰质炎病毒细胞系敏感性实验方法的建立[J] 中国计划免疫,2005,11(6):431~434�
  作者单位:150030 黑龙江省哈尔滨疾病控制中心�

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