中药经皮给药对乳腺增生病动物模型作用的研究思路

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　　摘 要：目的：探讨中药经皮给药治疗乳腺增生病的动物实验研究思路。方法：通过对乳腺增生病的中药经皮给药治疗实验研究的动物选择，动物造模方法，实验动物的给药途经与方法进行文献研究，阐述了经皮给药对乳腺增生病动物模型的作用机理。结果：中药经皮给药对乳腺增生病动物模型作用的实验研究，造模多选用大白鼠、家兔、豚鼠等，方法主要有雌二醇法、雌二醇配合少量黄体酮法、己烯雌酚法及病证结合造模法等。结论：通过乳腺增生病动物模型经皮给药途径进行实验，能够更好的研究中药经皮给药治疗乳腺增生病作用机理。
　　关键词：经皮给药；透皮吸收；乳腺增生病；大鼠
　　中图分类号：R-33
　　文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)03-0609-03
　　
　　Research Approach by Transdermal Therapeutic System of Traditional Chinese
　　Medicine to the Treatment of Hyperplasia of Mammary Glands in Animal Model
　　GONG Shao-bo1，LI Xiang-qi2，Song Ai-li3
　　(1.Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Laiyang 65200，Shandong China；2.Taishan Medical University，Tai'an 271000，
　　Shandong，China；3. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250012，Shandong，China)
　　Abstract：Objective：To investigate the research approach to the Treatment of Mammary Gland Hyperplasia by experiment on mammary gland hyperplasia. Method：We explain functional mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of mammary Gland hyperplasia in Animal model by transdermal Therapeutic System to study animal experiment literature of animal selecting，method of animal modeling，route and method of animal giving drug. Result：It was shown that，in the experimental study of animal model by traditional Chinese Medicine transdermal therapeutic System in the treatment of mammary Gland Hyperplasia(MGH)，most animal models are rats，rabbits，gninea pigs and so on，and the methods chosen are estradiol method，disthylstilbestrol method，progesterone and estradiol-added method，disease-symptom method. Conclusion：To learn more about the fictional mechanism of traditional Chinese medicine by transdermal therapeutic System in the treatment of mammary gland hyperplasia in animal model experiment.
　　Keywords：transdermal therapeutic system；transdermal absorption；hyperplasia of mammary glands (HMG)；rats
　　
　　乳腺增生病是一种既非炎症又非肿瘤的疾病，以乳房疼痛和乳房肿块为特征，一般经前加剧而经后减轻，属于中医“乳癖”范畴，发病与内分泌失调有关，目前尚无特效药。西医治疗多用激素制剂，能暂时缓解症状，但副作用大，长期服用疗效不确切，局部手术切除却不易为患者接受，又易复发。近年来中医药治疗本病取得了长足的进展，其中外治法更独具特色，疗效满意。经皮肤给药的外治法，除了能起局部作用外，还可以透过皮肤进入血液循环，发挥全身作用。此外皮肤角质还有贮存作用，使血药浓度曲线平缓，有着超越一般给药方法的独特优点，而且不受胃肠道理化因素的影响，从而提高了药物的生物利用度，减轻了药物的副作用。因此，探讨药物的透皮吸收，已成为近年来国内外研究的热点之一。为阐明乳腺增生病的发病机制，筛选有效的药物剂型，提供客观的实验依据，开发治疗乳腺增生病的新药，有必要进行经皮给药的动物实验研究。
　　
　　1实验动物的选择
　　
　　实验动物的选择，能够影响整个实验的过程和结果，必须进行合理选择实验动物的品种及级别。不同的动物对某一疾病的刺激有不同的反应，而且不同种类的动物生理特性也各有特点，这些特点与人的某些生理特性可能比较相似，这些相似之处正是为医学实验所需要的。乳腺增生病的模型动物要求与人类乳腺有相似的组织结构，尽可能的可以复制出符合实验要求的病理模型，通过药物的治疗干预，能够比较准确的解释作用机理。虽然各种哺乳动物乳腺的形状、大小、位置以及数量各有差异，但却有相同的组织学基本结构，即乳腺组织有腺泡和导管两部分构成，腺泡由分泌上皮构成，导管起源于与腺泡腔相连接的细小乳导管，细小导管又汇合成粗大的乳导管，最后在乳腺下部汇合成乳池。这些结构特征完全符合乳腺增生病的实验要求。实验动物选择的基本原则如下：(1)尽量选用与人体结构、功能、代谢及疾病特征相似的动物；(2)尽量选用标准化的实验动物；(3)尽量选用解剖、生理特点符合实验目的要求的动物；(4)尽量选用对刺激敏感、反应明显的动物；(5)尽量选用结构功能简单又能反映研究指标的动物。经皮给药治疗乳腺增生病的透皮吸收研究，除了要求复制合理的病理模型外，还应该有利于药物的涂抹或外敷，动物的皮肤有较好的吸收性，容易发挥药物的治疗作用。可以用于复制乳腺增生病病理模型的常见动物有Wistar大鼠、SD大鼠、豚鼠、成年雌性昆明种小鼠、新西兰兔、日本大耳白兔等。
　　
　　2动物造模方法
　　
　　医学研究认为乳腺增生病是由于体内雌激素水平过高，对乳腺组织长期作用的结果。根据该病因，乳腺增生病动物模型的造模方法主要有卵巢切除和卵巢健全两种。卵巢切除由于对实验动物有一定的创伤，可能会引入其他干扰因素，因此多采用人工雌激素对卵巢健全的实验动物诱发乳腺增生。乳腺增生病的发生与卵巢功能失调，雌、孕激素比例失调有关，所以常常采用外源性激素――雌、孕激素诱导动物乳腺组织增生而建立乳腺增生病的动物模型。有单纯使用雌激素，如雌二醇、雌三醇、雌酮；也有雌激素与孕激素合用，如雌二醇加黄体酮，通过肌肉注射或腹腔注射造模。饶金才[1]等选用雌性Wistar大鼠，肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/(kg・d)，连续25天，继而肌肉注射黄体酮4mg/(kg・d)，连续5天，或取雌性豚鼠，肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/(kg・d)，连续50天，继而肌肉注射黄体酮3mg/(kg・d)，连续10天，模型成功率为100%[1]。陈志春等选用雌性健康未孕Wistar或SD大鼠，在乙醚麻醉下，摘除双侧卵巢，缝合后于切口处敷以少量抗生素防治感染。手术后第2天起隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.3mg/(kg・d)，或雌三醇0.5mg/(kg・d)，连续15次，复制成乳腺增生病病理模型[2]。宿广峰等用雌性成年健康未孕Wistar大鼠，采用后肢外侧肌内注射苯甲酸雌二醇0.2mg/次，隔日1次，共15次，总剂量为3mg/只，复制成乳腺增生病病理模型[3]。也有使用其他药物造模的报道，刘轩等选用雌性未孕新西兰大白兔，5～6月龄，平均体重(2.73±0.25)kg，手术摘除双侧卵巢，于去卵巢1周后开始肌内注射雌二醇、黄体酮，每兔每天注射1次，药物剂量按成人每天剂量/50(kg)×10(倍)×兔体重(kg)计算。连续注射4周，复制成乳腺增生病病理模型[4]。倪瑾等选用雌性未孕青紫蓝家兔，体重2kg左右。手术摘除双侧卵巢，于去卵巢1周后开始肌内注射雌二醇0.3mg/kg，隔日1次，共30天，复制成乳腺增生病病理模型[5]。杨国汉等选用成年健康未生育雌性日本大耳白兔，年龄8～10个月，体重2～2.5kg，每天每只肌注雌二醇0.2mg/kg，连续30天，观察至实验结束，复制成乳腺增生病病理模型[6]。李建国等选用昆明种雌性小白鼠，体重(20±2)g，用苯甲酸雌二醇腹腔注射，隔日1次，每次0.5mg/kg，共15次，复制成乳腺增生病病理模型[7]。

　　使用其他药物造模：陈红风等选用清洁级成年未孕SD大鼠，平均体重(323.4±21.83)g，用胃复安溶液(浓度10mg/mL)灌胃，剂量按成人每天剂量/50(kg)×20(倍)×兔体重(kg)计算，每天1次，连续20天造成高催乳素血症的乳腺增生病病理模型[8]。
　　病证结合模型：宋爱莉等选用健康未孕成年雌性Wistar大鼠，体重180～220g，采用大鼠腿内侧肌内注射苯甲酸雌二醇0.25mg/(kg・d)，连续25天，然后肌内注射黄体酮2mg/(kg・d)，连续5天，复制成乳腺增生病动物模型，在此基础上，用夹尾方法激怒大鼠，每天0.5h，隔日给予饲养喂养，禁食当日给予大黄水煎液1g/(kg・d)灌胃，制成肝郁脾虚证乳腺增生病大鼠病理模型[9]。
　　可见用外源性激素――雌、孕激素诱导动物乳腺组织增生而建立乳腺增生病的动物模型具有一定的稳定性和先进性，适合乳腺增生病的研究。
　　
　　3实验动物的给药途经与方法
　　
　　在动物实验的过程中，应根据不同的实验目的、动物的种类、药物的类型来决定动物的给药途经与方法。实验处理用药有药饼喂食、中药灌胃、药物外敷，以及皮下注射、皮内注射、腹腔注射等，或在造模的同时给予治疗处理，或在模型复制成功后再给予治疗。中药经皮给药，是通过透皮吸收发挥治疗效应，所以采用经皮涂抹的给药方式，以透皮吸收的方式发挥药效作用。药物的透皮吸收过程包括释放、穿透及吸收入血液循环3个阶段。释放系统指药物从递质中(或基质中)释放出来而扩散到皮肤上；穿透系指药物进入皮肤内而主要对局部起作用；吸收系指药物穿入皮肤后通过血管或淋巴管进入体循环而产生全身作用。清代名医徐洞溪曾说：“用膏贴之，闭塞其气，使药性从毛孔而入其凑理，通经贯络，或提而出之，或攻而散之，较之服药尤有力，此至妙之法也。”古代医学家的这一皮肤吸收的机理，已被现代科学实验所证实。现代科学实验研究认为药物的透皮吸收首先应从皮肤的构造来认识。皮肤角质层是防止水份蒸发及抵御外部物质入侵的第一道屏障，故通过表皮的药物在真皮中很快被吸取，从而认为皮肤的吸收主要通过角质层细胞、细胞间隙或通过皮脂腺及汗腺。分子量小的药物能向角质层扩散，而分子量较大的药物则以毛孔及汗腺为途径的比例增大。现代医学证明，药物经皮肤吸收包括两个时相：①穿透相，药物通过皮肤表面结构角质层和表皮，进入细胞外间质。②吸收相，药物分子通过皮肤微循环，从细胞外液迅速地弥散入血液循环。穿透相较复杂，角化细胞含有结构脂质及水溶性物质，能缓慢吸收水分，细胞间隙充满着板层结构脂质，控制着水溶性溶质的扩散。由此可见，水溶性和脂溶性药物可经被动弥散，穿透角质层被吸收而发挥作用，可以作为实验用药途经。如李建国等将中药制成药味乳康罩包贴于大鼠的乳腺部位给药[7]。杨国汉则采用中药制成止痛散结膏外敷于乳腺增生病模型兔的乳房透皮给药[6]。达丽卿等将中药乳脐散外敷于模型兔的乳房和神阙穴进行实验研究[10]。王树荣等将外用乳宁霜稀释成乳宁液注射于大鼠的皮下来观察药物的疗效[11]。这些给药的方式均为临床用药提供了客观的研究思路。
　　
　　4经皮给药对乳腺增生病动物模型的作用机理
　　
　　4.1 对乳房形态 体积以及乳腺组织形态学的干预 观察实验动物的乳房、乳头外形和数目，测量乳房的大小、称重等比较直观，操作方便，容易掌握。杨国汉等设立乳房的大体形态判别标准：改变不明显者为(-)、单纯肿大者为(+)、红肿大者为(++)；并证实了止痛消结膏经皮给药可以有效的抑制乳腺增生病模型家兔的乳腺增生程度[6]。达丽卿建立了乳头形态学判断标准：无变化，光镜下基本恢复到正常乳腺结构为(-)；乳头大，光镜下可见结缔组织增生者为(+)；乳头肿大，光镜下可见结缔组织及腺导管增生者为(++)；乳头红、肿、大，光镜下可见结缔组织成纤维细胞增生，腺导管增生可见数目增加，管腔扩大，腺导管上皮增生者为(+++)；以此为检测指标，采用中药乳脐散外敷脐部，对用雌二醇复制的家兔乳腺增生模型有显著的治疗作用[10]。李建国等按病理程度不同分为4级：(-)乳腺小叶不增生，腺体数量极少，腺泡不扩张，处于静止状态；(+)乳腺小叶无明显增生，个别腺泡有轻度增生，无扩张；(++)乳腺小叶大部分增生，部分腺泡明显扩张；(+++)乳腺小叶明显增生，腺泡处于极度扩张状态，腺上皮细胞呈扁平状，腺泡内及导管内有大量的分泌物；研究结果表明药味乳康罩经皮给药，能够抑制模型小鼠的乳腺增生[7]。
　　4.2 对血清性激素及其受体的干预 中药对垂体――性腺激素有调节作用，能使其恢复周期性分泌节律，同时部分中药可能通过疏肝理气作用调整肝脏对性激素的灭活功能。通过中药的治疗，可以使乳腺增生患者血清垂体―性腺激素分泌节律恢复正常，表明中药对患者的内分泌功能有较好的调整作用，尤其是通过调整卵巢内分泌而影响组织细胞行为，消除乳腺小叶和乳腺管的病理状态，使其正常化，从而对乳腺增生病产生治疗作用。
　　雌激素受体是激素对靶器官发挥生物效应的媒介，当雌二醇异常升高时经雌激素受体的介导，通过完整的雌激素受体系统，使雌激素受体及孕激素受体的合成进一步增加，对雌二醇的依赖性、敏感性同步增加，引起乳腺上皮细胞的增生和细胞功能活跃。王雅如等研究克乳痛制剂(由鹿角片、牡丹皮、蛇床子、牡蛎等组成)对大鼠乳腺增生病的作用；同时对照观察乳腺的组织学形态，乳腺上皮细胞的雌激素受体，孕激素受体变化，并做核仁组成区相关嗜银蛋白染色及电镜观察。结果表明，中药克乳痛能抑制乳腺上皮增殖，对异常雌、孕激素造成的大鼠乳腺组织增生有明显的抑制作用。并认为异常雌激素的刺激可能主要通过雌激素受体及孕激素受体的介导引起大鼠乳腺组织增生，而克乳痛制剂能抑制大鼠乳腺上皮增生，并通过降低乳腺组织雌激素受体及孕激素受体含量，使乳腺组织对雌激素的敏感性下降，对本病产生治疗作用[12]。
　　此类报道多见于内服药物的干预作用，根据中医的“外治之理，即内治之理，外治之药，亦即内治之药，所异者法耳”的理论，经皮外用给药能够起到同样的效果。达丽卿等用中药乳脐散外敷干预大白兔乳腺增生病模型，实验结果显示在降低雌激素的同时还能够降低血液流变学的各项指标[10]。杨国汉等研究表明，止痛散结膏对乳腺增生病动物模型有显著的抑制作用，在降低血浆雌二醇的同时能显著抑制乳腺上皮细胞的雌激素受体的阳性率[6]。陆少波等采用中药外敷膏经皮给药干预治疗己烯雌酚复制的乳腺增生病家兔模型，结果中药外敷膏能明显抑制模型组家兔乳腺增生，减轻其病理变化，降低血清雌二醇的水平[13]。
　　另外内服中药可从整体上综合调整乳腺增生病患者神经内分泌免疫网络，上至神经递质、下至靶腺及免疫细胞的多环节、多层次、多途径的功能水平以及DNA损伤修复能力，从而提高了机体内环境的稳定能力，抑制了乳腺组织增生而起积极的治疗作用。如陈红风等采用胃复安灌胃的方法复制SD大鼠乳腺增生病模型，研究结果表明，调摄冲任法可通过增加下丘脑多巴胺浓度，抑制单胺氧化酶活性，从而增强多巴胺效应，降低催乳素水平，达到治疗目的[8]。刘丽军等实验观察了针刺对苯甲酸雌二醇腹腔内注射复制乳腺增生病小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响，表明针刺可提高模型小鼠NK细胞活性，对预防乳腺增生病癌变有积极意义[14]。

　　综上所述，中药经皮给药对乳腺增生病动物模型作用的实验研究，造模动物多选用大白鼠、家兔、豚鼠等，造模方法主要有雌二醇法、雌二醇配合少量黄体酮法、己烯雌酚法及病证结合造模法等。在经皮给药治疗乳腺增生病作用机理方面，主要是抑制乳腺组织的增生，调节体内雌孕激素相对平衡。此外，近年来研究中医药对雌激素和孕激素受体的影响以及对血液流变性的作用也日益受到重视。但乳腺增生病发病病因复杂，近年来的研究还发现，乳腺增生时自由基增多[15]；机体有一套抗氧化防御系统，一旦防御系统作用减弱或受损，导致机体MDA量升高，SOD活性下降，就会诱发或加重疾病。所以中医药治疗乳腺增生的作用机理，除调节雌孕激素平衡等作用外，抗氧自由基损伤和抗脂质过氧化损伤可能也是其作用机理之一，而目前有关这方面的研究报道较少。所以故今后尚需更广泛地研究中药透皮吸收的作用机制，通过经皮给药治疗乳腺增生的作用机理研究，以更好指导临床。
　　
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