针刺对光老化大鼠皮肤组织CAT、GSH-Px和H2O2影响的实验研究
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作者: 张小卿 陶冶 田国伟 吴景东
[摘要]目的：研究针刺对UV照射引起的皮肤光老化大鼠皮肤组织中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-Px）和过氧化氢（H2O2）的含量的变化，探讨针刺对抗皮肤光老化的作用机理。方法：将大鼠随机分成4组，除正常组外，其余各组模拟日光中UV（UVA+UVB）照射，造成皮肤光老化模型，每次造模前，针刺组给予电针刺激，阳性对照组采用VE涂抹造模部位，15周后对比各组生化指标结果。结果：模型组与正常组比较大鼠皮肤组织中CAT、GSH-Px活性明显降低，H2O2含量明显增加(P＜0.05)；针刺组与模型组比较CAT、GSH-Px活性增加，H2O2含量明显降低(P＜0.05)，与VE组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论：针刺可延缓UV引起的大鼠皮肤光老化，能增强皮肤组织中CAT、GSH-Px活性，降低H2O2含量。
[关键词]针刺；光老化；过氧化氢酶；谷胱甘肽氧化酶；过氧化氢
[中图分类号]R332 R758 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0958-02
光老化导致皮肤过早出现干燥粗糙、皮沟加深、毛细血管扩张及色素异常沉着等损美性症状，严重影响了人们的外貌美观，针刺通过经络-腧穴的全身整合作用在美容抗衰老的治疗方面有突出疗效,可引起人体各系统生理、生化水平上多项指标同步变化。为了探讨针刺治疗皮肤光老化作用机理，本实验通过测定光老化大鼠皮肤组织中与衰老有关的CAT、GSH-Px的活性及H2O2的含量来研究针刺抗氧化、延缓衰老的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组方法：健康雄性SD大鼠40只，体重（220±25）g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、针刺组、VE组。各组每5只放入一笼饲养，常规饲食和饮水，无不良因素影响，在相同的自然环境下饲养1周，待其适应实验室环境后开始进行实验。
1.2 主要试剂及设备：自制紫外线灯箱(40WUVB灯管4根，光谱集中在297nm；40WUVA灯管2根光谱集中在365nm)，UV辐照计(台湾路昌)，6805D电针仪，劲霸电推剪；CAT试剂盒、GSH-Px试剂盒、H2O2试剂盒（南京建成生物有限公司）；维生素E胶丸（天海药业）；-70℃冰箱、匀浆器、离心机、恒温水浴箱、分光光度计均由辽宁中医药大学实验教学中心提供。
1.3 实验方法：模型组大鼠不予任何治疗。针刺组大鼠在密封罐中用乙醚麻醉，昏迷后取出在大鼠固定架上捆绑，以28号0.5寸毫针针刺大鼠双侧“脾俞”、“肾俞”、“足三里”穴，直刺8mm，疏密波，刺激时间20min，以大鼠肢体或针柄微微颤动为度，每日一次,于针刺后30min开始造模。VE组大鼠于造模前30min，在背部剪毛区域内涂抹VE后造模。
1.4 造模方法：参考杨汝斌[1]SD大鼠皮肤光老化动物模型剂量及方法，每只大鼠均用电推剪剪除大鼠背部5.0cm×5.0cm区域内毛发，以后每次照射前用剃须刀剃除该部位的毛发。动物适应性喂养1周后，第2周开始将模型组、针刺组、VE组大鼠放入自制照射箱中，并置于距离光源30cm处的水平面上，第2周每天照射2h，第3～7周每天照射4h，第8～12周每天照射6h，照射以5天为一个周期，间隔2天，再开始下一个周期。至13周时终止UV暴露(UVA 照射强度累计为148.47J/cm2，UVB 辐照强度累计为48.67J/cm2)，继续观察1周。造模过程中每天观察动物背部皮肤有无水疱及糜烂等，如果出现上述症状，立即停止照射2～3天，至上述症状消失后再继续照射，直至造模成功。
1.5取材：15周后将各组大鼠断颈处死，迅速取背部光老化处皮肤组织全层,保存于-70℃冰箱中待测。
1.6 生化指标测量：紫外分光光度计分别测定各组大鼠皮肤组织中CAT、GSH-Px和H2O2的含量。
1.7 统计学方法：本实验数据采用SPSS（16.0）软件，运用多个样本均数比较的方差分析检验，数据以x±s表示，并用最小显著差法（LSD法）作两两比较。
2 结果与分析
2.1 各组大鼠皮肤组织中CAT活性比较：从表1可见，模型组大鼠皮肤组织中CAT活性明显降低，与正常组比较有统计学意义 (P＜0.05)；而针刺组CAT活性与模型组比较结果有差异(P＜0.05)，与正常组比较结果无差异(P＞0.05)，提示针刺提升了光老化大鼠皮肤组织中CAT活力，具有抗皮肤光老化作用，其疗效优于维生素E外用。
2.2 各组大鼠皮肤组织中GSH-Px活力比较：模型组大鼠皮肤组织中GSH-Px活力明显降低，与正常组比较有统计学意义 (P＜0.05)；而针刺组和VE组GSH-Px活力分别与正常组和模型组比较均有差异(P＜0.05)，提示针刺和局部外涂维生素E均能提升光老化大鼠皮肤组织中GSH-Px活力,二者疗效相似。
2.3 各组大鼠皮肤组织中H2O2含量比较：模型组大鼠皮肤组织中H2O2含量增加，与正常组比较有统计学意义(P＜0.05)；针刺组H2O2含量和模型组比较有差异(P＜0.05)。提示针刺在一定程度上可以降低光老化大鼠皮肤组织中H2O2含量疗效显著。
3 讨论
光老化是由于皮肤长期暴露于紫外线下而造成的慢性损伤。紫外线中UVB 可以直接作用于DNA，使其吸收能量，发生突变；而UVB与UVA产生的活性氧簇（ROS）可以间接损伤细胞核及线粒体DNA，导致细胞功能异常或凋亡。ROS分为两大类：自由基（例如：超氧自由基和羟自由基），非自由基成分（单线态氧和过氧化氢）。UVA 和UVB均可导致皮肤细胞膜附近产生ROS[2]。UV照射产生的ROS氧化损伤蛋白质及脂质，引起相应功能及结构的异常[3]。
CAT是一种酶类清除剂，它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2毒害，是生物防御体系的关键酶之一。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。
本课题组前期工作[4-6]曾研究过中药提取物（如白藜芦、葛根）对自然衰老小鼠皮肤组织中GSH-Px、抗超氧阴离子自由基、ATP酶、H2O2等指标的影响，结果均证实上述中药具有清除自由基和提升相关酶类活性的作用。本研究以皮肤光老化大鼠作为研究对象，探讨了针刺对细胞内抗氧化酶系CAT和GSH-Px的影响。结果表明了针刺可以提高光老化大鼠皮肤组织中CAT和GSH-Px的活力，从而降低H2O2对皮肤细胞的损伤，起到抗皮肤光老化的作用。
[参考文献]
[1]杨汝斌,万屏,刘玲,等．SD大鼠皮肤光老化动物模型建立方法的探索[J].中国皮肤性别学杂志,2011,25(3):199-202．
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[收稿日期]2012-03-08 [修回日期]2012-04-23
编辑/张惠娟
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