内源性神经激肽和降钙素基因相关肽在大鼠心肌缺血后适应对心肌超氧化物歧化酶的作用
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作者: 贾晓鹰 郭政 郭建丽 刘亚兵
【摘要】 目的：研究神经激肽1（NK1）、降钙素基因相关肽（CGRP）在大鼠缺血后适应对心肌超氧化物歧化酶（SOD）的作用。方法：随机将SD雄性大鼠（350～400 g）分为5组：sham组（只穿线不结扎冠状动脉）、I/R组（结扎冠状动脉左前降支30 min，再灌注120 min）、ipost组（结扎冠状动脉左前降支30 min，再灌注10 s夹闭10 s，如此反复3次后持续再灌注120 min）、CGRP8-37+ipost组（结扎冠状动脉左前降支25 min，按1μg/kg剂量从尾静脉给药CGRP8-37，5 min行后处理再灌注同ipost组）、D-SP+ipost组（结扎冠状动脉左前降支25 min，按1μg/kg剂量从尾静脉给药D-SP，5 min行后处理再灌注同ipost组）；快速液氮冷冻各组缺血心肌组织并提取心肌总蛋白，行总蛋白定量，用酶联免疫吸附技术检测心肌SOD的表达，分光光度法检测Caspase-3活性。结果：（1）与sham组比较，I/R组Caspase-3、SOD均增多（P<0.01）；（2）与I/R组比较，ipost组SOD增多（P>0.05），Caspase-3减少（P<0.01）；（3）与ipost组比较：CGRP8-37+ipost组SOD降低（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05），D-SP+ipost组SOD降低（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05）。结论：神经激肽1降钙素基因相关肽（CGRP）通过上调缺血心肌SOD表达对缺血后适应心肌起保护作用。
【关键词】 NK1受体； CGRP受体； 缺血后适应； 超氧化物歧化酶； Caspase-3
目前研究证实，缺血后适应对缺血再灌注心肌有保护作用[1-2]，也有研究证实，缺血心肌再灌注可造成缺血/再灌注损伤[3]，Kevin等[4]研究发现，再灌注早期心肌大量氧自由基产生可造成细胞的损伤使心肌细胞发生凋亡，且Caspase-3在凋亡中起重要作用[5]。而感觉神经通过释放感觉神经肽（CGRP和SP）可以减轻心肌缺血再灌注的损伤[6]。SOD是生物体内重要的自由基清除剂，在保护酶中起重要作用[7]。本实验拟探讨感觉神经肽在缺血后适应中对超氧化物歧化酶是否有影响。
1 材料与方法
1.1 材料 本研究采用大鼠作为研究对象。实验设计及过程符合本校伦理委员会要求并获批准。主要药品及试剂：ELISA试剂盒（检测SOD，RD，USA）；D-SP（Sigma，USA），CGRP8-37（Sigma，USA）。
1.2 大鼠心脏缺血再灌注模型 大鼠术前须禁食12 h，可自由饮水。称重后，20%乌拉坦（1.2 g/kg）腹腔注射麻醉后将大鼠固定于实验台，连接标准Ⅱ导联，尾静脉置入24 G套管留置针以方便给药。颈部皮肤消毒后于正中作一长约0.5 cm的切口，逐层钝性分离各层组织暴露气管，于甲状软骨下2～3 mm行气管切开，置入小动物用气管导管，用3-0慕丝线固定后逐层缝合皮肤切口。接小动物专用呼吸机行人工通气（呼吸频率70次/min，潮气量6～7 ml/次），稳定10 min左右，在大鼠左侧胸壁第3、4肋间距离胸骨左缘约0.5 cm开胸，逐层钝性分离暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方1～2 mm处以6-0无损伤缝合线穿针，进针深度1.5 mm左右，结扎冠状动脉左前降支30 min，松结扎线再灌注120 min。
1.3 实验分组 将实验动物随机分为5组，每组10只：sham组（只穿线不结扎冠状动脉）、I/R组（结扎冠状动脉左前降支30 min再灌注120 min）、ipost组（结扎冠状动脉左前降支30 min，然后行再灌注10 s夹闭10 s，如此反复3次后持续再灌注120 min）、CGRP8-37+ipost组（结扎冠状动脉左前降支25 min，按1μg/kg剂量给药CGRP8-37，5 min行后处理再灌注同ipost组）、D-SP+ipost组（结扎冠状动脉左前降支25 min，按1μg/kg剂量给药D-SP，5 min行后处理再灌注同ipost组）。
1.4 指标测定 用酶联免疫吸附技术检测心肌SOD的表达，分光光度法检测Caspaspase-3活性。
1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用两独立样本t检验和单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与sham组比较，I/R组SOD增多（P<0.01），Caspase-3增多（P<0.01）；与I/R组比较，ipost组SOD增多（P>0.05），Caspase-3减少（P<0.01）；与ipost组比较，CGRP8-37+ipost组SOD减少（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05），D-SP+ipost组SOD减少（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05）。见表1。
3 讨论
以往研究表明，缺血后适应对缺血心肌具有保护作用[8]，本实验研究结果显示，缺血再灌注心肌Caspase-3表达较假手术组明显升高，故认为缺血再灌注心肌细胞发生了凋亡，而缺血后适应心肌Caspase-3表达较缺血再灌注明显降低则证实以缺血后适应对心肌的保护作用，单独拮抗感觉神经肽（P物质或CGRP）后的缺血后适应心肌均较缺血后适应心肌Caspase-3表达升高，提示感觉神经肽参与了缺血后适应的心肌保护作用。本实验研究结果显示I/R组较sham组SOD表达显著升高，提示缺血引发应激反应刺激氧自由基保护酶表达升高[9]；ipost组较I/R组SOD表达升高，结合缺血后适应的心肌保护作用[10]，提示缺血后适应可能进一步激发SOD的表达对心肌起保护作用；单独拮抗感觉神经肽（P物质或CGRP）后的缺血后适应心肌均较缺血后适应SOD表达降低进一步提示感觉神经肽在缺血后适应中参与上调心肌SOD的表达。 综上所述，本实验结果显示，神经激肽1受体拮抗剂和CGRP受体拮抗剂可部分增强缺血后处理的心肌凋亡，并可显著抑制心肌超氧化物歧化酶的表达。提示内源性感觉神经肽SP、CGRP通过上调缺血心肌SOD的表达对缺血后适应心肌起保护作用。
参考文献
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（收稿日期：2013-02-28） （本文编辑：连胜利）
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