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自噬相关基因Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达及其意义

来源:用户上传      作者: 申增强 王世明 王小峰

  [摘要] 目的 检测自噬基因Beclin1、MAP1LC3B在原发性胆囊癌组织中的表达情况,探讨细胞自噬在胆囊癌发生中的作用及其临床意义。 方法 采用免疫组织化学SP方法,检测Beclin1、MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达情况,并以同期手术切除的胆囊炎性疾病组织为对照;统计Beclin1和MAP1LC3B的表达情况,并分析其与胆囊癌临床病理特征之间的关系。 结果 胆囊癌组和慢性胆囊炎组Beclin1的阳性表达率分别为45.7%和78.3%,MAP1LC3B的阳性表达率分别为47.8%和71.7%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。Beclin1和MAP1LC3B在不同年龄、性别、癌组织分化程度患者中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),但与周围脏器侵犯情况、病理TNM分期有关(P<0.05)。Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达水平呈正相关(r=0.538,P<0.01)。结论 胆囊癌组织中Beclin1和MAP1LC3B表达水平明显低于胆囊炎性疾病组织;Beclin1和MAP1LC3B的表达水平与胆囊癌侵袭能力及TNM分期有关,且两者表达呈正相关;提示Beclin1和MAP1LC3B是反映胆囊癌生物学行为的重要指标,两者之间可能存在着某种共同通路。
  [关键词] Beclin1;MAP1LC3B;胆囊癌
  [中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)02(b)-0007-04
  胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤,在消化系统恶性肿瘤中居第5位[1]。胆囊癌发病隐匿,恶性程度高,早期常无特殊临床症状,大量临床资料报道多患者在明确诊断时多已处于中、晚期,其中晚期患者5年生存率<5%[2]。胆囊癌的发病机制目前仍不明确。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡,已证实与肿瘤的发生、进展及肿瘤血管的形成等有关。Beclin1作为自噬形成过程中的一种重要正性调控因子,通过提高细胞自噬,能抑制肿瘤生长,是候选的抑癌靶基因[3]。有研究表明,微管相关蛋白1轻链3B(MAP1LC3)家族基因(MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C)是重要的自噬相关基因,其中MAP1LC3B 和MAP1LC3C 参与了乳腺癌细胞的自噬[4-5]。目前,有关Beclin1和MAP1LC3B 在胆囊癌中表达的研究较少。本文旨在检测Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌中的表达情况,并探究其临床意义。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料
  选取2008年1月~2011年12月山西医科大学第一附属医院普外科46例胆囊癌患者癌组织标本,取同期手术切除的46例慢性胆囊炎患者胆囊炎性组织作为对照。46例胆囊癌患者中,男20例,女26例,年龄43~80岁,平均65.5岁;46例胆囊炎患者中,男22例,女24例,年龄23~75岁,平均42.5岁。其中,腺癌40例,鳞癌6例;病理分级:低分化15例,中分化23例,高分化8例。患者术前均未接受任何放疗、化疗及生物、免疫治疗。所取标本均经甲醛固定,石蜡包埋,切片后用免疫组织化学方法检测。
  1.2 试剂及方法
  兔抗人Beclin1、MAP1LC3B单克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司,分别按1∶150及1∶200的比例稀释后作一抗,二抗和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。按SP法说明,进行免疫组织化学检测操作。采用阳性肿瘤标本作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。
  1.3 结果判定标准
  Beclin1与MAP1LC3B为淡黄色到棕褐色表达,颗粒状或均质状分布,Beclin1阳性表达见于细胞质和细胞膜;MAP1LC3B阳性表达见于细胞质。随机选择镜下5个高倍视野观察,计算1000个细胞,综合阳性细胞比率和着色深度评估,阳性细胞百分比<5%为0分,5%~50%为1分,~75%为2分,>75%为3分;细胞无着色评0分,淡黄色评1分,棕黄色评2分,棕褐色评3分。结果取2项评分之积,0分表示阴性;1~9分表示阳性。
  1.4 统计学方法
  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析;计数资料的比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法;相关性采用等级相关的Spearman检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 免疫组织化学检测结果
  2.1.1 Beclin1表达情况 在胆囊癌组织及胆囊炎性组织中均有Beclin1表达,胆囊癌中Beclin1的阳性表达率(45.7%)显著低于胆囊炎性组织(78.3%)(P<0.05)(图1)。
  图1 胆囊癌及慢性胆囊炎组织Beclin1表达免疫组织化学检测结果
  A.慢性胆囊炎;B.低分化胆囊癌;C.中分化胆囊癌;D.高分化胆囊癌
  2.1.2 MAP1LC3B表达情况 MAP1LC3B 在胆囊癌和胆囊炎性组织中均有表达,胆囊癌中MAP1LC3B的阳性表达率(47.8%)明显低于胆囊炎性组织(71.7%)(P<0.05)(图2)。
  图2 胆囊癌及慢性胆囊炎组织MAP1LC3B表达免疫组织化学检测结果
  A.慢性胆囊炎;B.低分化胆囊癌;C.中分化胆囊癌;D.高分化胆囊癌
  2.2 Beclin1和MAP1LC3B表达情况与胆囊癌临床病理特征的关系
  Beclin1和MAP1LC3B在不同年龄、性别、癌组织分化程度患者中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),但与周围脏器侵犯情况、TNM分期有关(P<0.05)(表1)。
  表1 胆囊癌组织中Beclin1和MAP1LC3B的表达情况与临床病理特征的关系(n)
  2.3 Beclin1与MAP1LC3B 表达的相关性   Spearman 相关分析显示,Beclin1与MAP1LC3B在胆囊癌组织中表达呈正相关(r=0.538,P<0.01)(表2)。
  表2 Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中表达的相关性(n)
  3 讨论
  自噬介导的细胞死亡不同于凋亡(Ⅰ型程序性死亡),被称为Ⅱ型程序性死亡。自噬过程在生物进化过程中高度保守,从低等生物酵母、果蝇到高等生物人均能找到自噬过程的同源基因。双层膜结构包裹部分或整个细胞成分,形成自噬泡,然后与溶酶体结合,形成自噬溶酶体,导致被包裹的物质和自噬体内膜的降解。通过自噬过程,细胞实现氨基酸、核酸等生物分子的循环使用[7],维持内环境稳态,清除衰老和无功能的细胞,抑制癌细胞过度增殖,清除病原微生物[8]。
  自噬体的形成与自噬相关基因(ATG)有关[9]。自噬体的形成过程中有3个关键步骤:ULK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、ATG13和FIP200形成ULK1复合物;Beclin1与Ⅲ型PI3K形成复合体;微管相关蛋白轻链3(LC3)的脂化[10]。
  Beclin1位于人染色体17q21上,大小约为150 kb,是酵母ATG6基因的同源物。Beclin1参与诱导自噬泡的行成。Beclin1与Ⅲ型PI3K形成复合体,能调控其他自噬蛋白在自噬前体中的结构定位[11]。研究发现,抗凋亡蛋白Bcl-2和Beclin1结合后,抑制Beclin1活性,降低自噬水平[12]。Liang等[13]发现与正常乳腺上皮结构中Beclin1蛋白高表达不同,乳腺癌组织中Beclin1表达显著降低。此后诸多研究阐明,与正常组织对比,Beclin1在食管癌[14]、卵巢癌[15]、喉癌[16]等多种肿瘤组织中的表达均明显降低,表明自噬对肿瘤的发生、发展有一定的抑制作用。
  LC3是酵母ATG8基因的类似物,定位于自噬前体和自噬泡的膜表面。MAP1LC3B是编码自噬相关蛋白的重要基因。在缺氧状态下,MAP1LC3B和ATG5表达能调控转录子ATF4介导的肿瘤细胞转移[17]。人MAP1LC3B并没有发生羧基端的切割反应,而且羧基端的甘氨酸被赖氨酸代替,成为人MAP1LC3B发生修饰反应的活性位点。人LC3A的膜定位与Gly120位点的切割和修饰密切相关,进一步研究表明参与其修饰的分子也与其他基因不同,以上结果提示MAP1LC3B存在翻译后修饰羧基端切割自噬作用[18-19]。
  恶性肿瘤的转移是一个多基因共同参与的多阶段过程,Beclin1和MAP1LC3可能与其他调控自噬的基因共同作用,抑制肿瘤转移。有研究表明PTEN可下调ClassⅠPI3K活性通路,可能使血管内皮细胞发生自噬性死亡,抑制新生血管形成,抑制肿瘤转移。
  综上所述,Beclin1与MAP1LC3B在胆囊癌中表达水平降低,说明自噬活性的降低参与胆囊癌的发生、发展。在肿瘤中,自噬起着“双刃剑”的作用,在低氧条件下,自噬可以通过能量物质的循环使用,避免细胞死亡;但自噬又是重要的细胞死亡途径。而自噬在胆囊癌中的具体调控机制有待进一步研究。
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  (收稿日期:2013-12-11 本文编辑:魏玉坡)
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